Na Tabela 11 estão apresentados os resultados das contagens de L. monocytogenes
obtidas nos oito modelos cárneos estudados, acrescidos e não acrescidos de nisina e O.E.O., após o armazenamento em refrigeração (5ºC) por 24h, 48h e 72h, e também nas amostras antes do início do armazenamento (0h). A Tabela 11 apresenta também as diferenças nas contagens de L. monocytogenes obtidas em cada um dos modelos cárneos em relação ao
modelo cárneo correspondente não adicionado dos antimicrobianos. Os resultados apresentados correspondem à média aritmética de três repetições. A representação gráfica dos resultados pode ser visualizada nas Figuras 5, 6, 7 e 8 onde estão apresentados os níveis de inibição de L. monocytogenes obtidos para cada uma das formulações durante 0h, 24h, 48h e
72h de armazenamento sob refrigeração, respectivamente. Para a melhor visualização do comportamento do microrganismo, em cada um dos modelos cárneos, ao longo de todo o período de armazenamento, a Figura 9 apresenta os resultados obtidos para todas as formulações.
Tabela 11. Contagens de L. monocytogenes (log UFC.g-1) nos oito modelos cárneos, com e sem antimicrobianos, após
armazenamento em refrigeração (5ºC) por até 72h.
Contagens de L. monocytogenes* Modelos cárneos Tempo de armazenamento em refrigeração modelo cárneo com nisina e OEO modelo cárneo sem nisina e OEO
∆log UFC.g-1 avaliação estatística** 0h 3,8 5,5 1,7 ± 0,34 h i 24h 3,8 5,5 1,7 ± 0,38 h i 48h 4,3 5,6 1,3 ± 0,45 d e f g h Formulação A (carne suína + todos os ingredientes) 72h 4,1 5,8 1,7 ± 0,46 h i 0h 5,3 5,7 0,4 ± 0,37 a 24h 5,0 5,8 0,8 ± 0,35 a b c d e 48h 5,1 6,1 1,0 ± 0,29 a b c d e f g Formulação B (carne suína apenas) 72h 5,1 6,2 1,1 ± 0,59 c d e f g h 0h 5,1 5,6 0,5 ± 1,00 a b 24h 4,5 5,7 1,2 ± 0,74 c d e f g h 48h 4,5 5,6 1,1 ± 0,26 c d e f g h Formulação C (carne suína + sal)
72h 4,2 5,9 1,7 ± 0,43 h i 0h 5,4 6,1 0,7 ± 0,69 a b c d 24h 5,7 6,5 0,8 ± 0,62 a b c d e 48h 4,6 6,0 1,4 ± 0,67 f g h i Formulação D (carne suína + açúcar) 72h 4,7 6,0 1,3 ± 0,71 d e f g h 0h 5,4 5,9 0,5 ± 1,03 a b 24h 5,2 5,7 0,5 ± 0,69 a b 48h 5,2 5,9 0,7 ± 0,72 a b c Formulação E (carne suína + condimentos) 72h 5,0 6,0 1,0 ± 0,71 a b c d e f g 0h 5,2 6,1 0,9 ± 0,84 a b c d e f 24h 4,9 6,3 1,4 ± 0,69 e f g h i 48h 5,0 6,1 1,1 ± 0,75 c d e f g h Formulação F (carne suína + sais
de cura) 72h 4,7 5,7 1,0 ± 0,89 a b c d e f g 0h 5,0 6,0 1,0 ± 0,91 a b c d e f g 24h 4,6 5,9 1,3 ± 1,20 e f g h i 48h 4,6 6,0 1,4 ± 1,20 e f g h i Formulação G (carne suína + emulsificante) 72h 4,7 5,7 1,0 ± 1,38 b c d e f g 0h 5,1 6,1 1,0 ± 0,61 a b c d e f g 24h 4,4 6,0 1,6 ± 0,72 g h i 48h 4,6 6,0 1,4 ± 0,37 e f g h i Formulação H (carne suína + antioxidantes) 72h 4,2 6,1 1,9 ± 0,59 i * médias de três repetições
Formulação A (carne suína + todos os ingredientes) Formulação B (carne suína apenas)
Formulação C (carne suína + sal) Formulação D (carne suína + açúcar) Formulação E (carne suína + condimentos) Formulação F (carne suína + sais de cura) Formulação G (carne suína + emulsificante) Formulação H (carne suína + antioxidantes)
Figura 5. Representação gráfica das diferenças nas contagens de L. monocytogenes obtidas nos diferentes modelos cárneos
adicionados de nisina e óleo essencial de orégano e nos correspondentes modelos cárneos não adicionados desses antimicrobianos, antes do início do período de armazenamento.
0 0,5 1 1,5 2 2,5 A B C D E F G H Formulações ∆ log UF C. g- 1
Formulação A (carne suína + todos os ingredientes) Formulação B (carne suína apenas)
Formulação C (carne suína + sal) Formulação D (carne suína + açúcar) Formulação E (carne suína + condimentos) Formulação F (carne suína + sais de cura) Formulação G (carne suína + emulsificante) Formulação H (carne suína + antioxidantes)
Figura 6. Representação gráfica das diferenças nas contagens de L. monocytogenes obtidas nos diferentes modelos cárneos
adicionados de nisina e óleo essencial de orégano e nos correspondentes modelos cárneos não adicionados desses antimicrobianos, após 24h de armazenamento sob refrigeração (5ºC).
hi abcde cdefgh abcde ab efghi efghi ghi 0 0,5 1 1,5 2 A B C D E F G H Formulações ∆ log U F C .g- 1 hi a ab abcd ab abcdef abcdef abcdef
0 0,5 1 1,5 2 2,5 A B C D E F G H Formulações ∆ l o g UFC. g-1
Formulação A (carne suína + todos os ingredientes) Formulação B (carne suína apenas)
Formulação C (carne suína + sal) Formulação D (carne suína + açúcar) Formulação E (carne suína + condimentos) Formulação F (carne suína + sais de cura) Formulação G (carne suína + emulsificante) Formulação H (carne suína + antioxidantes)
Figura 7. Representação gráfica das diferenças nas contagens de L. monocytogenes obtidas nos diferentes modelos cárneos
adicionados de nisina e óleo essencial de orégano e nos correspondentes modelos cárneos não adicionados desses antimicrobianos, após 48h de armazenamento sob refrigeração (5ºC).
0 0,5 1 1,5 2 2,5 A B C D E F G H Formulações ∆ log U F C .g- 1
Formulação A (carne suína + todos os ingredientes) Formulação B (carne suína apenas)
Formulação C (carne suína + sal) Formulação D (carne suína + açúcar) Formulação E (carne suína + condimentos) Formulação F (carne suína + sais de cura) Formulação G (carne suína + emulsificante) Formulação H (carne suína + antioxidantes)
Figura 8. Representação gráfica das diferenças nas contagens de L. monocytogenes obtidas nos diferentes modelos cárneos
adicionados de nisina e óleo essencial de orégano e nos correspondentes modelos cárneos não adicionados desses antimicrobianos, após 72h de armazenamento sob refrigeração (5ºC).
defgh abcdefg cdefgh fghi abc cdefgh efghi efghi hi cdefgh hi defgh abcdefg abcdefg bcdefg i
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 ∆ log UFC.g-1 A B C D E F G H Formulações 0h 24h 48h 72h
Formulação A (carne suína + todos os ingredientes) Formulação B (carne suína apenas)
Formulação C (carne suína + sal) Formulação D (carne suína + açúcar) Formulação E (carne suína + condimentos) Formulação F (carne suína + sais de cura) Formulação G (carne suína + emulsificante) Formulação H (carne suína + antioxidantes)
Figura 9. Representação gráfica das diferenças nas contagens de L. monocytogenes obtidas nos diferentes modelos cárneos
adicionados de nisina e óleo essencial de orégano e nos correspondentes modelos cárneos não adicionados desses antimicrobianos, durante todo o período de armazenamento sob refrigeração (5ºC).
Conforme apresentado na Tabela 11, o uso combinado de 200 ppm de nisaplin (Danisco) e 0,5% de óleo essencial de orégano em todos os modelos cárneos estudados resultou na inibição da multiplicação de L. monocytogenes durante o armazenamento em
refrigeração por 72h, confirmado resultados previamente obtidos por Kruger, 2006. No entanto, a intensidade da ação inibitória variou de um modelo cárneo para outro. Uma análise mais detalhada dos resultados apresentados na Tabela 11 e nas Figuras 5, 6, 7, 8 e 9 permite verificar que o modelo cárneo correspondente à formulação completa da lingüiça, adicionado de nisina e óleo essencial de orégano, foi o que resultou em maior diferença nas contagens de
L. monocytogenes quando comparado ao mesmo modelo cárneo sem os antimicrobianos,
durante todo o período de armazenamento em refrigeração estudado. A diferença média obtida nas contagens nos dois modelos foi de cerca de 1,7 log UFC.g-1 durante todo o período de armazenamento. Interessante observar que essa diferença nas contagens foi obtida já no tempo 0h, e não variou com o tempo de armazenamento, com exceção do tempo 48h onde foi obtida uma diferença de apenas 1,3 log UFC.g-1, porém este valor foi desconsiderado para a
análise dos resultados uma vez que a diferença de 1,7 log UFC.g-1 foi recuperada às 72h de armazenamento.
Resultados diferentes foram obtidos nos demais modelos cárneos. As diferenças médias na contagem de L. monocytogenes nos modelos com e sem os antimicrobianos, após o
primeiro contato com esses antimicrobianos, foi no máximo 1 log UFC.g-1. No modelo correspondente à carne apenas, a diferença foi a mais baixa de todas observadas (0,4 log UFC.g-1). Para os demais modelos estudados, a presença de sal (formulação C), de açúcar (formulação D), de condimentos (formulação E), de sais de cura (formulação F), de emulsificantes (formulação G), ou de antioxidantes (formulação H) afetou de maneira similar a diferença das contagens de L. monocytogenes no tempo 0h. As diferenças nas diferenças
médias de contagem não foram estatisticamente significativas (p >0,05).
Com exceção do modelo cárneo contendo todos os ingredientes e do modelo cárneo contendo apenas antioxidantes, nos demais as diferenças nas contagens de L. monocytogenes
nos modelos com e sem os antimicrobianos variou de modo similar ao longo do armazenamento até 72h. Os ∆log observados para as formulações C, D, E, F e G não diferiram estatisticamente daquele apresentado para a formulação B (p >0,05).
Os resultados apresentados indicam que a interação de todos os ingredientes usualmente empregados na fabricação de lingüiça frescal foi a que mais contribuiu para o efeito apresentado pelo uso combinado de nisina e O.E.O. Este comportamento pode ser confirmado observando-se as médias de redução da preparação composta apenas por pernil de porco moído, que apresentou as menores reduções na população de L. monocytogenes indicando um menor efeito antagônico dos antimicrobianos contra o patógeno nesta preparação. Comparando-se esses dados com resultados obtidos em estudos anteriores realizados no Laboratório de Microbiologia de Alimentos da FCF/USP (Kruger, 2006), verifica-se que comportamentos semelhantes foram observados testando-se diferentes formulações de lingüiça e seus efeitos na atividade antimicrobiana de nisina e O.E.O. no controle de L. monocytogenes Scott A neste alimento. Os estudos revelaram que uma maior inibição na multiplicação do patógeno foi obtida quando todos os ingredientes utilizados na formulação base foram empregados em conjunto e que esta redução foi mantida por até 48h de armazenamento sob refrigeração.
A importância das interações entre antimicrobianos utilizados como conservadores alimentares e os constituintes do alimento também já foram citadas por outros autores que avaliaram principalmente o efeito dos teores de gordura e proteína das matrizes na ação dos antimicrobianos e observaram que altos teores protéicos ou de gorduras podem promover uma
proteção dos microrganismos no alimento, reduzindo o potencial dos antimicrobianos (Aasen
et al., 2003; Burt, 2004; Deegan et al., 2005; Pol et al., 2001;).
Segundo Burt (2004), essas interações são responsáveis pelos diferentes resultados encontrados nos estudos que avaliam o potencial antimicrobiano de óleos essenciais utilizando metodologias in vitro e modelos alimentares.
Pol et al. (2001), estudando as influências da matriz alimentar na redução de Bacillus cereus por carvacrol, nisina e tratamento com pulso elétrico, relataram que a atividade da
nisina foi menor no leite quando comparada à atividade demonstrada em estudos in vitro e que o carvacrol não foi capaz de aumentar o efeito sinérgico entre o tratamento com pulso elétrico e a aplicação de nisina no modelo alimentar. Aasen et al. (2003) comentam que as ligações entre bacteriocinas e componentes alimentares podem reduzir sua ação antimicrobiana através da redução nas concentrações de bacteriocina livre no alimento. Singh
et al. (2003) avaliaram a eficiência de óleos essenciais como agentes antimicrobianos contra L. monocytogenes em salsichas do tipo hot dogs e puderam observar uma redução na
atividade antimicrobiana dos óleos essenciais proporcional ao aumento nos níveis de gordura encontrados nas matrizes alimentares. Os autores também realizaram testes in vitro e puderam observar maiores índices de inibição de L. monocytogenes do que aqueles apresentados para o modelo alimentar, atribuindo essa redução às interações entre os antimicrobianos e os constituintes do alimento. Lin et al. (2004) avaliando o potencial antimicrobiano de óleos essenciais contra L. monocytogenes em amostras de carne e peixe, também observaram que a presença de proteínas e gorduras nos alimentos pode diminuir a ação dos óleos essenciais por imobilizar os compostos com atividade antimicrobiana. Samelis et al. (2005), estudando os efeitos do uso combinado de nisina e ácidos orgânicos ou sais no controle de L.
monocytogenes em mortadela suína fatiada e armazenada sob refrigeração à 4ºC, comentam
que a redução do pH através da adição de ácidos orgânicos e a utilização de sais como benzoato e sorbato de potássio, podem contribuir para o aumento da atividade antimicrobiana de nisina contra L. monocytogenes, atribuindo ainda ao antimicrobiano um maior efeito na inibição da recuperação do patógeno durante o armazenamento sob refrigeração.
Avaliando-se separadamente o efeito de cada um dos ingredientes testados, temos que a formulação adicionada de antioxidantes foi a que apresentou a maior contribuição positiva para o aumento do efeito antagônico da nisina e do O.E.O. contra L. monocytogenes, uma vez que esta preparação foi responsável pelas maiores médias individuais entre os diferentes ingredientes durante o período de armazenamento, apresentando médias de redução superiores a 1,5 ciclos logarítmicos a partir de 24h. Vê-se também que, a partir de 24h de
armazenamento, o modelo adicionado de antioxidantes foi o único que apresentou diferença estatística com relação à formulação preparada sem adição de nenhum dos ingredientes até o final do armazenamento, com exceção do tempo de 48h onde as diferenças nas contagens de
L. monocytogenes entre as duas preparações não apresentou diferença estatística, porém a
intensidade de inibição na multiplicação do patógeno na formulação H foi recuperada às 72h de armazenamento.
A preparação adicionada de condimentos não apresentou aumento na redução da multiplicação da população microbiana comparada à carne sem adição de nenhum ingrediente, sugerindo que os condimentos não interferiram na atividade antimicrobiana de nisina e O.E.O. Estes resultados discordam de estudos anteriores realizados por Kruger (2006), onde contagens superiores de L. monocytogenes foram encontradas em amostras de
lingüiça frescal preparadas sem a adição de condimentos, sugerindo que estes componentes desempenham papel importante na atividade antimicrobiana de nisina e O.E.O. contra L.
monocytogenes. Porém, as formulações testadas nos estudos de Kruger não levaram em
consideração o efeito isolado de cada ingrediente utilizado, sendo que as formulações analisadas sem condimentos também não foram adicionadas de sal. Além disso, a formulação ainda continha outros ingredientes, como antioxidantes, açúcar, emulsificante, etc. Dessa forma, o efeito negativo da ausência de condimentos pode ser atribuído tanto à ausência de sal quanto às interações entre os outros ingredientes e os antimicrobianos.
Nos experimentos de Kruger também foram analisadas preparações de lingüiça frescal adicionadas de todos os ingredientes exceto sal e foi observado um aumento na ação antimicrobiana de nisina e O.E.O. contra L. monocytogenes nessas amostras. Porém, a recuperação do patógeno durante o período de armazenamento foi bem superior àquela encontrada nas demais amostras testadas. Estes resultados também diferiram dos encontrados no presente estudo, uma vez que a adição isolada de sal na carne de porco não exerceu ação imediata na atividade antagônica dos antimicrobianos, porém contribuiu positivamente para a inibição na multiplicação de L. monocytogenes em 72h de armazenamento, alcançando níveis de inibição do patógeno similares àqueles encontrados para a formulação completa e também para a formulação adicionada de antioxidantes. Essas diferenças podem mais uma vez ser atribuídas às diferenças entre as preparações testadas nos dois experimentos.
As preparações adicionadas de sais de cura e emulsificante apresentaram um comportamento semelhante, com aumento nas reduções de L. monocytogenes às 24h de armazenamento e mantendo estas reduções por até 48h. Porém, alcançando-se 72h de
armazenamento, permitiram a recuperação do patógeno, resultando na diminuição nas médias de redução.
Como já foi mencionado, a preparação adicionada de sal demonstrou um aumento na redução de L. monocytogenes apenas às 72h de armazenamento, enquanto a preparação
adicionada de açúcar apresentou um aumento na redução da população do patógeno a partir de 48h de armazenamento, mantendo esta redução até o final das 72h.
Estes resultados indicam que os compostos antioxidantes da lingüiça frescal possuem um importante papel na ação antimicrobiana de nisina e O.E.O., sendo responsáveis por um possível aumento na atividade antimicrobiana destes compostos. Uma possível explicação para este fenômeno seria a atuação dos compostos antioxidantes na estabilização de radicais livres que, por possuírem carga negativa, poderiam se ligar aos peptídeos catiônicos presentes na nisina, reduzindo assim a concentração de bacteriocina livre para atuar como agente antimicrobiano.
Pode-se observar também que, comparando-se todos os modelos cárneos estudados, a interação individual de cada ingrediente utilizado na formulação da lingüiça com os antimicrobianos apresentou menor contribuição para a atividade antimicrobiana em relação àquela apresentada pela formulação completa que foi responsável pelo maior efeito positivo na atividade antimicrobiana de nisina e O.E.O. contra L. monocytogenes neste produto.
5.2 Avaliação da interferência do tempo de contato da nisina e do óleo essencial de