Como intervalos de referência fisiológicos, foram utilizados os dados do Sistema Internacional de Informação das Espécies (Conventional U.S.A. Units –Outubro de 1999), Gallus Gallus, calculado para ambos os sexos e todas as idades combinadas, são valores de referência de amostras apresentadas por 11 instituições, e Campbell in Thrall et al., (2012).
TABELA 1. Valores de referência de Gallus Gallus fisiológicos para volume
globular (VG em %), proteína plasmática total (PPT em g/dL) e alanina aminotrasferase (ALT em UI/L) segundo Campbell in Thrall et al., (2012). triglicérideos (mg/dL), Colesterol (mg/dL), Fosfatase Alcalina (ALP em UI/L), aspartato aminotransferase (AST em UI/L) segundo o Sistema Internacional de Informação das Espécies (Conventional U.S.A. Units –Outubro de 1999).
VG
(%) (g/dL) PPT Triglicérideos (mg/dL) Colesterol (mg/dL) (UI/L) ALP (UI/L) AST (UI/L) ALT 23 A 55 2,5 a 4,5 57 a 2207 76 a 296 107 a 5030 125 a 299 19 A 50
3.7.1. Etapas experimentais
Na primeira etapa experimental (in vivo), foram analisadas em dez momentos, a cada cinco dias, foram realizados: exame clínico, MCE, qPCR, IgY, VG, PPT e bioquímica sérica.
Na segunda etapa experimental (in vitro), as amostras de meio de cultivo obtidas foram analisadas em nove momentos, a cada cinco dias, foram realizadas as análises de MCE e qPCR.
3.7.1.1. Exame clínico
Para realização do exame clínico, foi realizada a inspeção do ambiente e observação do comportamento individual das aves diariamernte. A cada cinco dias era realizada a contenção das aves para avaliação geral onde eram observadas a coloração das mucosas, aspecto dos olhos, ouvidos, narinas, bico, cavidade oral, asas, membros, penas e cloaca, posteriormente era
realizada a pesagem por meio de balança digital e aferição de temperatura utilizando termômetro clínico de mercúrio seguindo referência semiológica descrita por Werther in Feitosa (2008).
3.7.1.2. Avaliação da espiroquetemia por meio de Microscopia de Campo Escuro (MCE)
A avaliação da concentração de espiroquetas in vivo, foi realizada em câmara de Neubauer em microscópio de campo escuro (Nikon E200®), com objetiva de 20x. Utilizando para contagem, quando necessário, a diluição do soro parasitado em solução salina de PS, na concentração de 1:10, a espiroquetemia foi avaliada tambeém quanto a sua motilidade seguindo protocolo semelhante ao de Dhawedkar e Dhanesar (1983), sendo classificada em cruzes, onde quatro cruzes representam motilidade intensa, três cruzes representam motilidade vigorosa, duas cruzes representam motilidade ativa,
uma cruz representa pouco ativa e o número zero representa ausência de motilidade.
3.7.1.3. Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa (qPCR)
O DNA das amostras de sangue das galinhas foi extraído de 10 μL do sangue total, utilizando-se o Illustra Blood Mini Spin Kit. O DNA das amostras de meio de cultura foi extraído de 10μL do meio BSK, posterirormente foi centrifugado a 10.000rpm/min, durante 10 minutos e o sobrenadante foi retirado, o conteúdo foi ressuspendido em 100μL de H2O nuclease free e 100μL de resina Chelex 110® (BioRad), novamente o sobrenadante foi retirado e acondionado em um tubo ependorff. Controles negativos, água nuclease free, foram adicionados a cada placa teste.
Os primers foram desenhados e testados no Instituto de Biociências, Departamento de Microbiologia e Imunologia, Laboratório de Virologia e Diagnóstico Molecular da Universidade Estadual Paulista "Julio de Mesquita Filho", Campus Botucatu - SP, por meio de análise nos programas PrimerBLAST. Os primers utilizados foram: B. anserina fla gene 127-151
(CGTCAGCTATTAATGCTTCAAGAAA) e B. anserina fla gene 127-151
(CGTCAGCTATTAATGCTTCAAGAAA).
As reações de qPCR foram realizadas em placas contendo 96 poços de 0,5mL, onde foi adicionado 18μL da solução de trabalho, composta por 1.000μL de goTaq® qPCR Master Mix Promega, 60μL de cada primer e 680μL água nuclease free, e 2μL de amostra de DNA extraído, totalizando o volume final de 20μL.
O DNA extraído das amostras de sangue e do meio de cultura BSK, foi amplificado por meio de PCR em Tempo Real para a determinação da carga parasitária, utilizando o equipamento 7500 Fast Real-Time PCR (Applied Biosystems).
A reação consistiu em 2uL de amostra de DNA total, 10uL de Go Taq SYBR Master Mix (Promega), 6pmol de cada primer e água nucleasse-free para completar 20uL. Os ciclos de tempo e temperatura consistiram em uma desnaturação inicial por 5 minutos a 95ºC, seguida de 40 ciclos de 15 segundos a 95ºC, 1 minuto a 60ºC, e a curva de dissociação (15 segundos a 95ºC, 1 minuto a 60ºC, 30 segundos a 95ºC e 15 segundos a 60ºC), para cada placa testada, foi adicionado um controle negativo (água nuclease free).
Para a realização da curva-padrão, foram utilizadas amostras de DNA extraídas de sangue total de galinhas positivas para Borrelia anserina, nas concentrações decrescentes de 440000, 44000, 4400, 440, 44 espiroquetas/μL, todas analisadas em duplicata. Os dados foram coletados e analisados com o auxílio do Programa 7550, Software v.2.0.6. Para todas as análises considerou-se slope de -3,724 a - 3,717, R2 de 0,998, intercept de 40,439 e eficiência de 85,563%, para as análises dos resultados.
3.7.1.4. Ensaio de Imunoadsorção Enzimático indireto (ELISA indireto)
Os soros obtidos das poedeiras foram submetidos à pesquisa de anticorpos da classe de Imunoglobulina Y (IgY) contra antígeno bruto de B.
anserina utilizando o Ensaio de Imunoadsorção Enzimático (ELISA) indireto
padronizado por Cordeiro et al. (2012).
Neste ensaio foram utilizadas microplacas de poliestireno de 96 orifícios (NUNC Surface ®) sensibilizadas com 100 μL do antígeno de B. anserina, cepa
oriunda de Pedro Leopoldo - MG, diluído a 5 μg/mL em tampão carbonato pH 9,6 e incubadas durante 12 horas em câmara úmida à 4ºC. Após a sensibilização, as placas foram lavadas três vezes com Tampão salino fosfato (PBS Tween 20 0,05% pH 7,4); posteriormente bloqueadas com 200 μL de Leite em pó 6% diluído em PBST e incubadas em câmara úmida por 90 minutos, em estufa bacteriológica a 37º Celsius. Em seguida realizou-se novamente três lavagens das placas com PBST.
Foram utilizadas 10 amostras negativas de animais previamente testados e um controle positivo em duplicata de um animal inoculado com antígeno inativado de B. anserina. Os 10 controles negativos, o controle positivo e os soros testes foram diluídos na concentração de 1:800 em PBST e dispostos 100 μL nas placas, que foram incubadas à 37º Celsius por 90 minutos e, posteriormente lavadas como na etapa anterior. Então, foi disposto 100 μL do conjugado IgG de coelho (KPL®) na diluição de 1:4000 em PBST com mais 90 minutos de incubação nas condições citadas anteriormente, seguindo novamente as lavagens das placas. Após esta última incubação foram empregados 100 μL do substrato revelador Paranitrofenilfosfato de Sódio (PNPP - SIGMA Chemical) diluído em Tampão de Dietanolamina pH 9,8 na concentração de 1 mg/mL. As leitura das placas foram realizadas em espectrofotômetro para microplacas de 96 poços, durante 15 minutos (Termo Scientific® Uniscience Multiskan FC), sob comprimento de onda de 405 nm.
A linha de corte (cut off) foi obtida e estimada pelo valor das médias das densidades ópticas dos controles negativos multiplicado por 2,5. A atividade imunológica dos soros testes foi calculada para determinação das amostras positivas em cada diluição, considerando o soro controle positivo e os negativos, como a equação a seguir (MACHADO et al., 1997):
Valor real = (Densidade óptica amostra – média de negativos) (Média de positivos – média de negativos)
Para corrigir o efeito da variação da densidade óptica (DO) obtidas com a leitura de cada placa testada, o valor de cutoff de cada uma das placas foi igualado a 100 (DO soro teste x 100/cutoff) e os resultados de cada soro teste expressos na forma de Índice de Densidade Óptica (IDO). Todas amostras que
obtiveram um resultado acima de 100 foram consideradas positivas (CORDEIRO et al. 2012).
3.7.1.5. Volume Globular (VG) e Proteína Plasmática Total (PPT)
A determinação da Concentração do Volume Globular (VG) foi feita seguindo o método de microhematócrito, conforme descrito por Weiss e Wardrop (2010). A determinação da concentração de Proteína Plasmática Total (PPT) foi realizada pela técnica de refratometria, segundo Feldman (2000).
3.7.1.6. Bioquímica sérica
As amostras de sangue foram centrifugadas a 5.000 rpm por 10 minutos imediatamente após a colheita; em seguida o soro foi congelado para posterior análise. A concentração de colesterol, triglicerídios, fosfatase alcalina, alanina aminotransferase, aspartato aminotransferase foram obtidas pela dosagem no analisador bioquímico com kit da BioClin®, no aparelho Cobas Mira Plus da Roche®.