Corroborando com os achados relatados em estudos anteriores, o estresse salino também limitou severamente o crescimento de plantas de sorgo, entretanto, verificou-se maior produção de biomassa no genótipo tolerante (CSF20)(Figuras 2 e
3). Plantas do genótipo CSF18 se mostraram altamente sensíveis à salinidade. Os
resultados demonstraram que o padrão de tolerância é decorrente de respostas complexas, tanto a nível transcricional como funcional, bem como envolve inúmeros processos metabólicos.
A eficiência do aparato fotossintético é crucial para a tolerância à salinidade
A fotossíntese é o principal processofisiológico dos vegetais, e é altamente sensível ao estresse salino, constituindoum fator limitante para o crescimento de inúmeras espécies de plantas, o que a torna um importante marcador de tolerância (NEGRÃO et al., 2017; ACOSTA-MOTOS et al., 2017). No presente estudo, a fotossíntese foi negativamente afetada pelo estresse salino, em plantas de sorgo de ambos os genótipos; contudo, um melhor desempenho fotossintético sob salinidade foi observado nas plantas do genótipo CSF20(Figura 4A). Os resultados sugerem que os efeitos deletérios da salinidade foram decorrentes de fatores não estomáticos, pois embora a gstenha sido levemente reduzida (Figura 4C) em ambos
os genótipos, as concentrações internas de CO2 (Ci) se mantiveram inalteradas ou
foram aumentadas pelo estresse salino (Figura 4E). Além disso, sob salinidade, plantas do genótipo tolerante apresentaram maior eficiência de carboxilação da Rubisco que àquelas do genótipo sensível (Figura 4D), o que coincidiu com a
175 ativação de diversos genes relacionados com o metabolismo do carbono (Figura 21
e Tabelas 6e S3) e a maior produção de biomassa no genótipo CSF20 (Figura 3).
O melhor desempenho fotossintético das plantas do genótipo CSF20 pode ser atribuído à melhor eficiência fotoquímica do fotossistema II (Figura 5). Sob salinidade, a alta eficiência quântica efetiva do PSII (ΔF/Fm’) (Figura 5A) foi
correlacionada com o maior fluxo de elétrons através da CTE (ETR) (Figura 5E) e maior dissipação fotoquímica (qp) (Figura 5C). Além disso, sob estresse salino, as
altas taxas de assimilação de CO2 e a maior eficiência fotoquímica do genótipo
tolerante coincidiram com o acúmulo de pigmentos fotossintéticos (Figuras 4, 5 e 6). Interessantemente, o maior conteúdo de clorofilas e carotenoides nas folhas das plantas do genótipo tolerante foi concordante com a regulação positiva do gene HEMA1 (glutamil-tRNA redutase 1) (Tabelas 6e S3),que é responsável pela síntese de precursores da clorofila e reconhecidamente importante nas respostasà seca (PEREMARTI et al., 2014) e à salinidade (TURAN; TRIPATHY, 2015; SKORUPA et al., 2016; HAJRAH et al., 2017).
Plantas CSF20 mostraram altos níveis de expressão de genes que codificam para a Ribulose 1,5-bisfosfato carboxilase / oxigenase (Rubisco) (genesRBCS1A e RCBL)(Figuras 4, 5, 6 e 48H; Tabelas 6e S3). Recentes estudos têm salientado a importância da subunidade menor da Rubisco, que é codificada por uma família multigênica RBCS nuclear, para a manutenção da fotossíntese frente a condições ambientais adversas (MASTROBUONI et al., 2012). Em Arabidopsis, a expressão dos genes RBCS1A e RBCS3B contribuiu fortemente para a produção e acúmulo da Rubisco, resultando na manutenção da capacidade fotossintética das plantas sob condições de alto e baixo CO2(IZUMI et al., 2012).
De modo similar, Jiang e colaboradores (2012) e Huang e colaboradores (2017) mostraram que a expressão do gene RBCS1A foi regulada positivamente em plantas de Populus yunnanensis e Arabidopsis pumila, respectivamente, sob condições de estresse salino. Ao mesmo tempo,Tao e colaboradores (2013) atribuíram a alta expressão do gene RBCL em plantas de Perennial ryegrass, genótipo BARLP 4317 (tolerante ao excesso de sais), como um dos mecanismos responsáveis pela tolerância à salinidade.
176 No genótipo sensível, a menor eficiência fotossintética foi atribuída a uma baixa eficiência fotoquímica, evidenciada pelas reduções nos parâmetros de ΔF/Fm’, ETR e qp, bem como pela maior relação ETR/A, indicando um dreno alternativo para dissipação de elétrons (Figuras 4 e 5). O aumento da relação ETR/A indica um desequilíbrio entre o fluxo de elétrons na CTE dos tilacóides e a assimilação de CO2
durante a fotossíntese (KITAO et al., 2003; GEORGIEVA et al., 2007; SILVA et al., 2011). Nesse sentido, os elétrons não empregados na assimilação de CO2 podem
ter sido direcionados para outros processos celulares, incluindo a fotorrespiração, metabolismo do nitrogênio ou a reação de Mehler (BAKER et al., 2007; RIBEIRO et al., 2009). Assim, um maior indicativo de dreno alternativo de elétrons (↑ETR/A), associado com a menor eficiência de carboxilação da Rubisco (↓A/Ci), sugere uma perda na eficiência fotoquímica nas plantas estressadas do genótipo CSF18, o que pode ter ocasionado menor produção de ATP e NADPH para as reações de carboxilação da Rubisco (Figuras 4A e 5).
Notavelmente, a inibição do transporte de elétrons fotossintéticos (Figura 5E) pode também ter promovido um acúmulo excessivo de EROs, resultando em danos oxidativos nas membranas celulares (Figura 9) e interrompendo a homeostase redox celular. Como consequência, as EROs em excesso acarretaram danos severos ao aparato fotossintético, incluindo a degradação dos pigmentos fotossintéticos e de componentes estruturais dos fotossistemas (Figura 6). Essa ideia é apoiada pelos dados de transcriptômica, em que plantas do genótipo CSF18 mostraram altos níveis de expressão de genes relacionados à montagem/reparo dos fotossistemas I e II (Figuras 19Ae 22; Tabelas 6e S3); sugerindo que a degradação dos componentes estruturais dos fotossistemas pode ter sido o fator preponderante para a menor eficiência fotoquímica e consequente redução na assimilação de CO2das plantas CSF18 submetidas ao estresse salino (Figuras 4, 5, 19Ae 22).
Ainda nessa linha de raciocínio, recentes estudos têm demonstrado que espécies tolerantes aos sais apresentam menor expressão de genes que codificam componentes estruturais da cadeia de transporte de elétrons (CTE) tilacoidal. Exemplos disso foram reportados nos estudos de Guan e colaboradores (2017) com plantas de Chrysanthemum crassum, uma espécie tolerante à salinidade. Os autores demonstraram que os genes LHCA4 (chlorophyll a/b binding protein
177 4), PsbA (photosystem II protein D1), PsbO (photosystem II oxygen-evolving enhancer protein 1), PsaD (photosystem I subunit II) e PsaH (photosystem I subunit VI) foram regulados negativamente pela salinidade. Resultados semelhantes foram também observados para plantas de sorgo do genótipo CSF20 (Tabelas 6e S3). O controle restrito da homeostase iônica está intimamente relacionado à aclimatação ao excesso de sais
Diversos estudos têm demonstrado que o controle refinado da homeostase iônica, envolvendo principalmente os íons Na+ e K+, é um fator preponderante para a tolerância de plantas ao estresse salino (MUNNS; TESTER, 2008; CRAIG PLETT; MØLLER, 2010; PENG et al., 2016; MIRANDA et al., 2016; MIRANDA et al.,2017; ASSAHA et al., 2017). Corroborando com essa hipótese, sob salinidade, plantas do genótipo CSF20mostraram menor acúmulo de Na+e maior de K+ nas folhas e,
consequentemente, estabeleceram uma maior relação K+/Na+ quando comparadas
com plantas do genótipo CSF18(Figura 8). Tais resultados estão de acordo com estudos prévios com plantas de sorgo, em que genótipos tolerantes apresentaram maior capacidade para evitar o acúmulo de íons tóxicos, tais como o Na+, e para manter níveis adequados de K+, principalmente na parte aérea (LACERDA et al.,
2001; LACERDA et al., 2003).
Em glicófitas, a redução do acúmulo de Na+ nos tecidos pode ocorrer pelo aumento da exclusão desse íon nas células das raízes; redução no carregamento de Na+no xilema ou intensificação de sua retirada antes de chegar à parte aérea; aumento da recirculação dos sais da parte aérea via floema; aumentoda compartimentação ou da alocação dos sais para locais particulares da parte aérea (como as folhas mais velhas) (MUNNS; TESTER, 2008).
Nesse estudo, a redução no acúmulo de Na+ nas folhas do genótipo tolerante pode ter sido decorrente de dois mecanismos principais (Figura 8). Primeiro, plantas CSF20 provavelmente ativaram mais eficientemente a via de sinalização SOS nas raízes, que culminou na exclusão de Na+ mediada pelo antiporte Na+/H+ (SOS1) e menor carregamento do xilema, conforme descrito previamente por Miranda e
colaboradores (2017).Segundo, o Na+ absorvido e translocado para os tecidos
aéreos pode ter sido compartimentado nos vacúolos através da operação do antiporte Na+/H+ (NHX). Essa ideia é corroborada com a expressão do gene que
178 codifica para a proteína NHX2 (ID: Sb09g003590) que, na presença de NaCl, foi muito superior nas folhas das plantas do genótipo tolerante (contagem por milhão - 198,4) em comparação ao genótipo sensível (contagem por milhão - 0,92) (Tabela
6).
O aumento da operação do antiporte NHX nas folhas de plantas CSF20 pode ter sido resultado de uma rede complexa de sinalização envolvendo a ativação do gene SOS2, em via uma via independente de alguma ativação do geneSOS3 (QIU et al., 2004; KIM et al., 2007; HUERTAS et al., 2012). Curiosamente, plantas estressadas CSF20 mostraram expressão altíssima dos genes que codificam para a proteína SOS2 (Tabelas 6 e S1), sem haver correlação com incrementos na expressão do gene SOS1, que foi detectado em níveis baixíssimos (Dados não
mostrados).
Vale ressaltar que plantas do genótipo sensível podem também ter ativado os mesmos mecanismos de exclusão de Na+ nas raízes e compartimentação dele na parte aérea, porém em menor intensidade. Mesmo assim, para evitar a exposição massiva dos tecidos fotossintetizantes à toxicidade do Na+, as plantas provavelmente ativaram mecanismos de recirculação desse íon, promovendo o carregamento dele na seiva do floema por meio da atividade de transportadores HKT. Nesse grupo de plantas sob estresse, o gene HKT1 foi super expresso nos tecidos foliares (contagem por milhão - 440) quando comparado com plantas CSF20 (contagem por milhão - 30,6) (Tabela 6). Entretanto, os mecanismos de recirculação não foram eficientes para evitar o acúmulo de Na+ emníveis tóxicos nos tecidos aéreos, especialmente nas células do mesofilo, o que resultou em danos severos no aparato e eficiência fotossintética e, consequentemente, aumentou a sensibilidade de plantas CSF18 ao estresse salino (Figuras 3, 4, 5, 6 e 8).
A aclimatação ao estresse salino é correlacionada com menores danos oxidativos e maior funcionamento do sistema antioxidante de defesa
Como citado anteriormente, plantas do genótipo CSF20 mostraram menores danos de membrana (Figura 9), um padrão de resposta normalmente observado para espécies tolerantes ao estresse salino (FERREIRA-SILVA et al., 2008;GADELHA et al., 2017; RAHMAN et al., 2017). Nesse grupo de plantas, a redução dos danos oxidativos foi atribuída a maior intensificação do sistema
179 antioxidante de defesa, envolvendo principalmente as enzimas CAT e GPOD(Figura
10A e 10C).
A maior operação do sistema antioxidante de defesa nas plantas CSF20 foi correlacionada com a regulação positiva dos genes NOA1 (sintetasedoóxido nítrico sintetase)e MPK1 (proteína quinase fostatase 1 mitogeno ativada) (Tabelas6 e S1), os quais estão envolvidos nas vias de sinalização para a manutenção do equilíbrio redox em plantas. Evidências disso foram reportadas por Ahmad e colaboradores (2016) e Gadelha e colaboradores (2017)em plantas de Cicer arietinume Jatropha curcas, respectivamente. Os autores demonstraram que a aplicação exógena de óxido nítrico (NO) estimulou a atividade das enzimas antioxidantes, o que limitou o acúmulo excessivo de EROs e atenuou os efeitos deletérios da salinidade sobre o crescimento das plantas. Além disso, a cascata de sinalização da MAPK também foi citada por estar envolvida nas vias de transdução de sinais (envolvendo NO, EROs e ABA) para eliminação de EROs durante a resistência aos estresses bióticos e abióticos (ZHOU et al., 2014; LIU; HE 2017). Em Arabidopsis, o gene MPK1 foi super expresso sob salinidade eidentificado como decisivo para a aclimatação ao estresse salino(ZAIDI et al., 2016). Os autores relataram que o gene MPK1 atua como regulador positivo na ativação das enzimas antioxidantes (tais como dismutase do superóxido, catalase e peroxidases), aliviando os danos oxidativos nos tecidos das plantas (ZAIDI et al., 2016).
Os genes CHS e HEMA1, com eficiência comprovada na indução do sistema antioxidante (THU-HA et al.,2011; LIJUAN et al., 2015; PI et al., 2016;), também apresentaram regulação positiva e podem estar envolvidos nas rotas de sinalização que medeiam as respostas das plantas do genótipo CSF20 ao estresse salino (Figura 19B; Tabelas 6e S3). Curiosamente, a atuação do gene CHS, que codifica para a enzima-chave da via de biossíntese de flavonoides(FINI et al., 2011; AGATI et al., 2012) foi fundamental para a regulação da homeostase redox e tolerância à salinidadeem plantas de soja (PI et al., 2016) e de tabaco (LIJUAN et al., 2015). Convém salientar que, no genótipo tolerante, embora o gene APX4(Tabelas 6e
S3)tenha apresentado regulação positiva nas plantas estressadas com NaCl, essa
modulação não foi refletida em atividade da enzimaAPX (Figura 10B), sugerindo que modificações pós-transcricionais ou traducionais se sobrepõem ao controle transcricional.
180 Em adição aos genes citados anteriormente, genes envolvidos na biossíntese de carotenoides (que atuam como precursores de hormônios vegetais e substâncias antioxidantes), foram mais expressos nas folhas das plantas do genótipo tolerante CSF20 (Tabelas 6e S3). Nesse sentido, além de auxiliar na manutenção dos níveis de pigmentos fotossintéticos e assimilação de CO2(Figuras 4, 6 e 19B), a alta
ativação dessa via provavelmente resultou em uma maior capacidade antioxidante, um fenômeno frequentemente observado em inúmeras espécies de plantas (PANG et al., 2008; CHEN et al., 2016; WEI et al., 2017, PANDEY et al., 2017).
Ao contrário do observado nas plantas CSF20, os resultados mostraram que a APX e SOD foram as principais enzimas responsivas à salinidade no genótipo sensível (Figura 10B e D), porém as respostas foram menos eficientes para evitar danos oxidativos às membranas celulares (Figura 9) e ao aparato fotossintético (Figuras 4, 5 e 22), resultando na maior sensibilidade das plantas ao excesso de sais (Figura 3). O aumento da atividade da APX foi resultado de um controle transcricional, pois plantas estressadas apresentaram maior número de transcritos (contagem por milhão) dos genes APX1 (742), APXtilacoidal (147) e APXestromal (383) que plantas controle (360, 14 e 35, respectivamente) (Tabela 6). Os resultados sugerem que, nas condições experimentais analisadas, as enzimas CAT e GPOD são mais determinantes para o controle da homeostase redox nas folhas das plantas de sorgo que as enzimas APX e SOD.
As rotas de transdução por fitohormônios envolvem vias intricadas durante as respostas de aclimatação ao estresse salino
A resposta das plantas a determinado estresse envolve inúmeras alterações de processos biológicos, as quais são influenciadas/alteradas pelo balanço hormonal. Os hormônios etileno (ET), ácido salicílico (SA) e jasmonato (JA) desempenham papéis importantes na mediação da defesa da planta contra estresses abióticos (RYU; CHO, 2015),entretanto a maioria das rotas de defesa de plantas contra estresses abióticos (seca, salinidade, frio etemperatura elevada) é mediada principalmente pelo ácido abscísico (ABA) (ZHANG, et al., 2006; ZHU, 2016; VISHWAKARMA et al., 2017). A elevação dos níveis de ABAdesencadeia a sinalização em cascata de inúmeros genes responsivos a estresses (ZHU, 2016), podendo envolver a participação de mensageiros secundários (tais como o Ca2+ e
181 EROs) (SAKAMOTO et al., 2008), desencadeando respostas de defesa (JIANG; ZHANG, 2002).
No presente estudo, apenas plantas do genótipo tolerante mostraram aumentos na expressão de genes relacionados à sinalização dependente de ABA (Figuras 17A, 19B, 20, 48G e 48J; Tabelas 6, S1 e S3). Durante as repostas ao estresse salino, o ABA pode ter sinalizado direta e indiretamente para modular diversos processos fisiológicos e metabólicos nos tecidos das plantas de sorgo:
(i.) sinalizado para um controle refinado da condutância estomática (Figuras 4C e