Os dados foram descritos por frequências absolutas e relativas. Para comparação dos grupos, foi utilizado o teste exato de Fisher. O nível de significância adotado foi = 0,05. Os dados foram analisados com o programa SPSS, versão 13.0.
6 RESULTADOS
Do total de 24 ratos, a metade realizou injeção portal de células mononucleares da medula óssea, e a outra metade, injeção salina. Ocorreram sete mortes nas primeiras 24 h após a injeção (29,2%), sendo três no grupo da terapia celular (25%) e quatro no grupo controle (33,3%), relacionadas diretamente ao procedimento, sem significância estatística (teste exato de Fisher; p = 1,000); a mortalidade relacionada ao procedimento decorreu, mais frequentemente, de sangramento intra-abdominal, o que pode ser identificado na ultrassonografia (Figura 3).
Figura 3 - Imagem ecográfica da via biliar distendida com líquido na cavidade abdominal relacionado ao sangramento pós-punção.
Após a ligadura da via biliar para causar dilatação e consequente cirrose, houve uma compressão do parênquima hepático e maior dificuldade para puncionar a veia porta por via trans-hepática (Figura 4).
Figura 4 - A imagem acima evidencia a distensão da via biliar que desloca a veia porta. Essa modificação anatômica dificulta o acesso para a punção trans-hepática.
Também foi mensurado por ultrassonografia com Doppler colorido o calibre da veia porta dos ratos durante a execução de experimento, obtendo-se valores do diâmetro portal entre 1,6 e 1,9 mm (Figura 5).
Veia cava Veia porta VSH
Fluxo portal
Figura 5 - A imagem ecográfica acima permite a visualização das veias porta e cava e a mensuração do calibre portal. Na linha inferior, registra-se o fluxo portal.
Restaram oito ratos no grupo controle e nove ratos no grupo tratado, que foram submetidos a eutanásia 14 dias após a injeção portal para análise final.
A análise imuno-histoquímica do tecido hepático do receptor demonstrou que o percentual de repovoamento das CMMO na veia porta por via percutânea, orientada por ultrassonografia, apresentou uma eficácia de 77,8% (7/9), identificando-se as células do doador no órgão receptor.
A caracterização fenotípica das células mononucleares da medula óssea utilizadas no grupo tratado foi determinada por citometria de fluxo e demonstrou que 31,5% das células apresentavam marcador CD45. O CD49b estava presente em 1,65% das células, e o CD90 estava presente em 31,15% das células transplantadas, adequado aos objetivos do estudo.
Figura 6 - Histograma mostrando o número de eventos e a intensidade de fluorescência (FITC) para (A) CD45, (B) CD49b, (C) CD90.
Fígados de ratos que receberam transplante celular foram submetidos a imuno-histoquímica com anticorpo anti-Sox 18 para verificar a incorporação de células provenientes do doador macho. Entende-se por incorporação de células a nidação, fusão e/ou fagocitose dessas células no parênquima hepático do animal receptor.
A análise do tecido hepático demonstrou que a injeção de CMMO na veia porta evidenciou que, dos nove ratos que receberam a infusão celular, sete apresentaram forte marcação do anti- Sox 18, o que representa uma eficácia de 77,8% do procedimento para incorporação das células do doador no órgão receptor (Figura 7), principalmente em região periportal. Em dois animais, não foram identificadas células que expressassem o marcador anti-Sox 18.
E V E N T O S E V E N T O S E V E N T O S
Figura 7 - Fotomicrografia de fígado de ratos mostrando a marcação para Sox-18 pela técnica de imuno-histoquímica com contra-coloração pela hematoxilina-eosina.
Nota - A e B representam fígados de ratos que receberam transplante de células mononucleares de medula óssea de 10x e 40x, respectivamente, onde se observa a marcação cromógena para Sox 18; C e D representam fígados de ratos do grupo controle com aumento de 10x e 40x, respectivamente.
Quando se analisou a repopulação do tecido hepático por células mononucleares da medula óssea dos animais (n = 7), evidenciada pela marcação positiva para o anticorpo Sox-18, comparado com os fígados que não apresentaram marcação para esse anticorpo (n = 10), verificou-se que, além da redução da fibrose hepática, 0,99% (0,46 a 2,82) versus 1,88% (0,72 a 4,77), com p = 0,043, houve também melhora dos níveis de albumina, 2,66 ± 0,27 g/dL versus 2,16 ± 0,36 g/dL, com p = 0,008 (Tabela 1).
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Tabela 1 - Comparação por incorporação celular com o percentual de fibrose em ratos Wistar com cirrose induzida
Variável Células Sox-18 + n = 7
Células Sox-18 - n = 10
7 DISCUSSÃO
A exequibilidade e a eficácia da técnica proposta foram satisfatórias, pela alta taxa de incorporação celular no parênquima hepático, mesmo considerando a alta mortalidade, consequente à punção direta da veia porta por via percutânea e trans-hepática.
A inexistência de uma técnica de infusão diretamente no sistema portal ou arterial em ratos constituiu a motivação da execução do presente experimento. Em se tratando de um procedimento de elevada acurácia, utilizou-se a ultrassonografia com Doppler colorido como um recurso para visualizar a anatomia venosa portal e, por conseguinte, que esses objetivos facilitassem a infusão de células-tronco diretamente no sistema portal.
Um dos resultados importantes a ser considerado nesta pesquisa foi de que houve alta mortalidade dos ratos puncionados. Esse alto índice de mortalidade pode estar relacionado à alteração anatômica causada pela distensão da vesícula biliar, em função da ligadura do colédoco e consequente dilatação.
O calibre da veia porta dos ratos, avaliado com o auxílio da ultrassonografia com Doppler colorido, e o fluxo portal auxiliam na localização do vaso, por ser extremamente pequeno (1,6 a 1,9 mm) comparado com 4,0 a 6,0 mm de animais de maior porte e 8,0 a 10,0 mm em seres humanos. Isso traduz uma grande dificuldade técnica para a infusão intraportal de células-tronco. Provavelmente em decorrência dessa limitação técnica, não se encontram na literatura científica trabalhos utilizando essa abordagem percutânea da veia porta em ratos Wistar.
A despeito de ter ocorrido um elevado índice de mortalidade pelo motivo acima exposto, ressaltamos que, em 16 ratos, a técnica de punção percutânea foi satisfatória quando consideramos a incorporação das células mononucleares da medula óssea do animal doador no parênquima hepático do rato cirrótico receptor. A sobrevida de aproximadamente 70% dos animais, aliada à eficácia do transplante celular, permite considerar essa técnica de extrema utilidade para estudos posteriores.
Ainda relativamente aos resultados obtidos, destacamos que houve 77,8% de incorporação celular, índice satisfatório com a técnica de acesso à veia porta empregada, diferentemente dos estudos de Sato e cols. (46) e Aurich e cols. (81), nos quais, após uma injeção simples celular,
apenas 1 a 3% do fígado normal foi repovoado pelas células do doador. Além disso, essa população celular tende a decair com o tempo (82).
A fenotipagem das células mononucleares injetadas demonstrou que 31,5% das células transplantadas apresentavam marcadores de células-tronco hematopoiéticas (CD 90), enquanto apenas 1,65% das células apresentavam marcadores de células epiteliais, plaquetas e linfócitos (CD 49b), indicando que a população celular injetada estava adequada aos objetivos do estudo.
Outro resultado obtido que justifica o êxito da técnica foi a constatação de que, além da evidência de que as células derivadas da medula óssea do doador nidaram, no fígado de quase 80% dos animais submetidos a terapia celular a maior densidade celular localizou-se na área periportal, que é o local de maior injúria tecidual.
A observação de uma grande população de células com morfologia de hepatócitos provenientes do doador, portanto, reforça a ideia de que a injeção local é a via ideal para a terapia celular, mesmo sabendo-se da presença de fatores quimiotáxicos que possam contribuir para o sucesso do tratamento quando usado sistemicamente (83). O fato de não ter sido observada incorporação celular em dois animais está de acordo com outros estudos, como o de Nakamura e cols. (84) e o de Quintanilha e cols. (85), que evidenciaram maior eficácia na repopulação após injeções celulares sucessivas. Assim, embora haja maior probabilidade de êxito com a técnica de injeção intraportal, provavelmente cerca de 1/5 dos animais necessitariam de infusões adicionais
Observamos melhora da fibrose após a infusão celular. Yamamoto e cols. (86), usando anticorpos anti-Liv8, marcador de células-tronco hematopoiéticas, mostraram que as células- tronco Liv8 negativas (células-tronco mesenquimais) melhoram a função hepática e reduzem a fibrose em maior proporção que as células Liv8 positivas, sugerindo que as células-tronco mesenquimais têm maior participação no processo de repopulação e melhora da função sintética. Entretanto, outros trabalhos bem conduzidos, como o de Carvalho e cols. (87), não demonstraram eficácia do transplante isolado de células-tronco mesenquimais em modelos de hepatopatia crônica, sugerindo, que, além do efeito celular, outras variáveis, como fatores de crescimento em geral, possam contribuir para o sucesso do transplante de células de medula óssea (88). É possível que a infusão da fração mononuclear de células de medula óssea seja estabelecida com terapêutica eficaz para hepatopatias crônicas, pois nela encontramos também a presença de células produtoras de fatores de crescimento. Estudos adicionais são necessários, e o estabelecimento da técnica de punção percutânea da veia porta em ratos com cirrose experimental
constitui-se em um instrumento de estudo que poderá substanciar o potencial terapêutico das células-tronco na cirrose humana.
8 CONCLUSÕES
As observações do estudo da infusão intraportal de CMMO em modelo de cirrose induzida em ratos permitem concluir que:
1. A técnica de injeção de células-tronco diretamente na veia porta por via transcutânea e guiada por ultrassonografia revelou-se exequível;
2. A mortalidade relacionada ao procedimento foi de 29,2%; as dificuldades técnicas foram decorrentes do reduzido diâmetro da veia porta (1,3 a 1,6 mm) e da dilatação da vesícula biliar em razão da técnica de cirrose experimental utilizada;
3. A fenotipagem das células mononucleares injetadas demonstrou que 31,5% das células transplantadas apresentavam marcadores de células-tronco hematopoiéticas;
4. A injeção intraportal de CMMO por via percutânea mostrou a incorporação das células do animal doador em 77,8% dos animais receptores com cirrose experimental;
5. A maior densidade das células injetadas ocorreu no espaço periportal, com redução da fibrose tecidual.
6. Houve redução significativa de fibrose tecidual após o transplante intraportal de CMMO.
9 PERSPECTIVAS
Com o desenvolvimento da técnica de injeção intraportal por via percutânea de células- tronco da medula óssea em ratos com cirrose experimental, descortina-se uma série de possibilidades de estudos. Assim, pretendemos evoluir na investigação da regeneração do tecido hepático, tipos celulares, resposta bioquímica e funcional. Além disso, em se tratando de uma técnica inédita, esperamos reproduzir os achados obtidos em animais de maior porte com a veia porta de maior diâmetro, reduzindo os níveis de complicação no momento da punção percutânea.
O avanço no conhecimento básico do potencial terapêutico das células-tronco na cirrose hepática é necessário para que essa técnica seja validada no tratamento de cirrose em humanos, dentro de padrão ético e com bases científicas adequadas. Esperamos, no futuro, aplicar essa técnica de punção percutânea da veia porta no tratamento de pacientes com cirrose utilizando células-tronco, visto que esse procedimento em seres humanos já é realizado em larga escala nos procedimentos de radiologia intervencionista para o tratamento de algumas patologias hepáticas.
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