No hipocampo humano, verificamos diferença significativa quanto a expressão relativa de HCN1 e HCN4, mas não HCN2, em relação aos seus
respectivos controles, entre tecido hipocampal humano de pacientes THTC versus THET. A expressão relativa de HCN1 e HCN4 estavam reduzidas quando comparadas com os seus respectivos controles.
Em nosso estudo o grupo THET apresentou uma redução de quase 60% de HCN1 em relação ao THTC. Em hipocampos com esclerose (EH) já havia sido relatado alteração dos níveis de expressão de HCN1 tanto na forma de mRNA quanto na proteína nos hipocampos (Bender et al, 2003). Na camada piramidal de CA1, onde a perda celular é mais proeminente, os níveis de mRNA foram mais baixos, a perda só não foi maior por que há uma certa preservação dos interneurônios que sobreviveram (Babb et al, 1989). Na região do GD há uma robusta expressão dos HCN1, devido ao brotamento (sprouting) anormal da camada granular com redução visível da densidade celular (Bender et al, 2003).. Finalmente, no hipocampo humano com a patologia característica de EH era quase desprovido de mRNA HCN1 expresso nos neurônios hilares refletindo a perda celular nesta área (Bender et al, 2003).
A análise quantitativa do grupo EH revelou duas vias de integridade da camada granular e de expressão de mRNA HCN1. Quando há preservação relativa destas células (EH moderada) o de mRNA HCN1 se expressa de fraco- moderadamente. Quando a densidade neuronal é reduzida para menos que 50% da autópsia ocorre uma upregulation de mRNA HCN1 na camada granular.
A modificação dos níveis de mRNA HCN1 é acompanhado pelo aumento do sinal da proteína. Estes resultados sugerem que a perda celular severa no GD pode ser a causa do mecanismo do aumento do de mRNA HCN1. Entretanto não é o que acontece em CA1. O aumento de HCN1 no giro denteado também foi observado no modelo da pilocarpina.
No presente trabalho, a redução HCN2 não foi significativa entre THTC versus THET. Bender et al (2003) verificou que na camada granular não houve alteração dos níveis de mRNA HCN2 no tecido com esclerose hipocampal (EH) severa comparada com a EH moderada e sem EH, contudo houve um aumento significativo de 80% por célula na expressão de mRNA HCN2. No mesmo estudo, Bender et al (2003) observaram ratos epilépticos os níveis de mRNA HCN2 estavam reduzidos , assim como nossas observações em CA1, CA2 e subículum, nos animais com epilepsia crônica. Entretanto, Bender et al (2003), não evidenciaram redução na expressão em células individuais. Esses dados indicam que no hipocampo ocorrem mudanças modestas no mRNA HCN2 em face da perda neuronal, comparada com a
downregulation nos níveis de mRNA HCN1. Este estudo mostrou que tanto HCN1-4 estão expressos no hipocampo humano e que mRNA HCN1 diminuído em hipocampos THET. Além disso, também foi observado diminuição de mRNA HCN1 no modelo de epilepsia crônica e um aumento de HCN2 em animais tratados com pilocarpina na fase crônica (Bender et al 2003).
Brewster et al (2002) demonstraram que as crises induzidas em fases precoces da vida modulam a expressão dos genes HCN. Além disso, em CA1, mesmo expressando as múltiplas isoformas de HCN, existe uma redução de mRNA HCN1 e um aumento de mRNA HCN2 (Brewster et al 2002). Essa mudança ocorre na presença de um aumento do input inibitório nesta região (Chen et al, 2001). No modelo de crises em fases precoces não há perda celular (Bender et al, 2003) e desta forma pode-se especular que as mudanças observadas nos níveis de mRNA HCN1 possa ocorrer ao aumento do input hiperpolarizante e conseqüente ativação desse canal.
Deve ser notado que a redução de mRNA HCN1 e em modelos de animais com cérebros imaturos é concorrente com o aumento de expressão de mRNA HCN2, acompanhada pela cinética lenta e mudanças na curva de ativação voltagem- dependente da IH na direção despolarizante (talvez atribuída a alteração celular do AMPc ou sensibilidade do canal) gerando as descargas em salva (Dubé et al, 2000, Chen et al, 2001, Brewster et al 2002). Não obstante, os dados sugerem que ocorra uma desregulação transcripcional em uma ou mais isoformas das subunidades HCNs e que esta condição possa estar envolvida na ELT humana. Além disso, essas alterações podem estar relacionadas à refratariedade. Entretanto, essas alterações, pode ser conseqüência pró-epileptogênica nos hipocampos com esclerose, um mecanismo compensatório ou simplesmente coincidência.
Finalmente, olhando o estágio final da epilepsia refratária humana, não nos permite extrapolar outras causas para a alteração de expressão. Assim, a expressão alterada de HCN1 mRNA pode ser conseqüência da perda de interneurônios, das células musgosas e das células granulares (CGs), gerando alteração do balanço da excitação/inibição das CGs sobreviventes, ou de outras combinações fatores não testados (Swanson et al, 1998; Williamson et al, 1999). Conseqüentemente, trabalhos adicionais em modelos in vivo, in vitro, e em modelos computacionais são importantes para decifrar o papel desta " canalopatia transcripcional” na patogênese da epilepsia hipocampal humana.
Os níveis de mRNA HCN1 e HCN2 foram expressos no tecido hipocampal humano, com distribuição similar com as descritas para roedores. A expressão de mRNA HCN1 foi robusta nas células piramidais de CA1 e presumivelmente nos interneurônios no hilo do giro denteado, contudo os níveis na camada granular eram inferiores. Os níveis de mRNA HCN2 eram inferiores na formação hipocampal.
Entretanto, a desregulação na expressão do mRNA HCN ocorrida no tecido hipocampal humano com epilepsia é diferente das mudanças que ocorrem em modelos de roedores com cérebros imaturos de roedores. Assim, no giro denteado, a expressão de HCN1 mRNA estava aumentada nas células granulares individuais em hipocampos com EH com perda celular na camada do giro denteado. Deve se levar em consideração que a perda celular no GD é menor se comparado com CA1 e CA3c(CA4) (Haas et al, 2002).
No estudo realizado por Bender (2003), a redução ~50% da densidade das CG do giro denteado foi um limiar aparente para o aumento drástico nos níveis de expressão do HCN1 mRNA. Especulou-se que a mudança nos níveis se deva à perda neuronal, e que esta provoque alterações no input inibitório e excitatório nas CG do giro denteado sobreviventes disparando desta forma um processo de neuroplasticidade na expressão de HCN mRNA. Certamente, ambos reduziram a inibição (Willianson, 1999) e aumentaram o input excitatório (Isokawa et al, 1997). Estes fatos sugerem que no primeiro caso pode ser conseqüência da destruição dos interneurônios no hilo e no segundo, conseqüência do brotamento das fibras musgosas. De acordo com este cenário, face o aumento do input hiperpolarizante nas populações interneurônios intactos (como no estudo de crises em fases precoces) (Chen et al, 2001; Brewster et al, 2002) a expressão de HCN1 mRNA pode declinar. Contrastantemente, a perda dos interneurônios e a redução da inibição perissomática na esclerose hipocampal humana severa, pode talvez aumentar a excitação dendrítica e com isto aumentar a expressão de HCN1 mRNA. Os resultados de Bender et al(2003) indicaram que o modelo da pilocarpina corrobora com este cenário. Como em humanos, eles encontraram upregulation de
HCN1 mRNA CG sobreviventes. Embora que, comparado com o material humano, a perda nas CG do GD neste modelo animal fosse relativamente modesto.
Entretanto, a perda do GC foi acompanhada pela redução dos neurônios hilares e isto geraria perda da inibição (Kobayashi e Buckmaster, 2003; Sloviter et al, 2003) o que poderia ser uma causa determinante para o aumento dos níveis do HCN1 mRNA nas CG.
Adicionalmente a inibição alterada, a excitação aumentada no GD e o brotamento das fibras musgosas contribuíram para a regulação do HCN1 mRNA. Em modelos experimentais umas séries de trabalhos associam o brotamento das fibras musgosas com a hiperexcitabilidade na epilepsia temporal (Isokawa et al, 1997). Teleologicamente, o aumento da densidade de HCN1 geraria um aumento da concentração da corrente IH nos dendritos como “tentativa de proteção” à
excitabilidade no soma (Magee, 1998; Poolos et al, 2002). Assim, o upregulation do HCN1 mRNA acrescida de mudanças morfológicas, fisiológicas e neuroquímicas têm sido relatadas nas CGs da formação hippocampal humana com HS (Isokawa et al,, 1997; Jeub et al, 1999; Mathern et al, 1999; Nägerl et al, 2000). As mudanças plásticas similares, tais como aumento da expressão da enzima sintetizadora de GABA (glutamato descarboxilase) (Schwarzer e Sperk, 1995), têm sido relatadas nos modelos experimentais de ELT humano.