Há cerca de três décadas foram identificadas as primeiras mutações somáticas associadas ao gene Ras e desde essa época se tem atribuído às proteínas codificadas por este funções essenciais nas vias de transdução de sinal que controlam a proliferação celular, sobrevivência e diferenciação (Fernández-medarde & Santos, 2011). Mutações oncogénicas no gene Ras são frequentes, e centram-se na inativação da função GTPase o que torna a proteína constitutivamente ativa (Rajalingam et al., 2007) tendo por consequência a ativação de vias de sinalização envolvidas na proliferação e sobrevivência celular como é caso das vias MAPK/ERK e PI3-K/Akt e paralelamente, devido à ativação da via MAPK/ERK, a transcrição da enzima NOX1, induzindo desta forma a produção de ERO mais especificamente de H2O2 (Adachi et al., 2008; Castellano
& Downward, 2011; Meier, 2005; Mendoza et al., 2011).
As ERO são tumorigénicas devido à capacidade que possuem em induzir vias de transdução de sinal que regulam a proliferação celular, sobrevivência e migração celular e também por mutagénese de DNA. São ainda capazes de causar lesões devido à oxidação do DNA, de proteínas e lípidos. Diversos estudos apontam para a elevada produção de ERO em células epiteliais tanto in vivo como in vitro estando as células em constante stress oxidativo o que as torna dependentes de proteínas antioxidantes.(Liou & Storz, 2012; Storz, 2005; Ziech, Franco, Pappa, & Panayiotidis, 2011)
Recentemente foram atribuídas à anexina A2 funções antioxidantes devido ao resíduo de cisteína reativo Cys-8 que, na presença de H2O2 é oxidado de forma reversível. A
anexina A2 encontra-se sobre-expressa em vários tipos de cancro, estando positivamente associada com a progressão tumoral (P. A. Madureira et al., 2011). No entanto a atividade antioxidante da anexina A2 não foi ainda testada em células a sobre- expressar H-Ras.
44
5.1 - Análise da expressão das vias de sinalização celular e das proteínas
do sistema antioxidante
No ensaio representado pela figura 4.2, na linha celular HT1080 HRas p36-4 a expressão de HRas é mais elevada comparativamente com as células HT1080 HRas p36-scramble, a maior expressão é consequência do aumento da estabilidade proteica verificado no ensaio com ciclohexamida (figura 4.5). Na linha celular MDA-MB 231 não se verificou o mesmo resultado pelo que aparenta não ser um mecanismo adotado por todos os tipos celulares, pois as células HT1080 derivam de uma linha celular de fibrossarcoma, pelo que são células mesenquimais enquanto as MDA-MB 231 derivam de um adenocarcinoma de mama sendo uma linha celular de origem epitelial.
Analisando as figuras 4.3 e 4.4 nas células HT1080 e MDA-MB 231 H-Ras verificou-se um aumento significativo na expressão das vias de sinalização celular PI3-k/Akt e ERK 1/2 em comparação com as células controlo HT1080 e MDA-MB 231 pBABE. Estes resultados evidenciam que a sobre-expressão de H-Ras ativa as vias envolvidas na proliferação e sobrevivência celular.
Verificou-se também um aumento na ativação da via de sinalização PI3-k/Akt nas linhas celulares HT1080 e MDA-MB 231 H-Ras p36-4 quando comparadas com as respetivas células controlo HT1080 e MDA-MB 231 H-Ras p36-scramble o que indica a anexina A2 desempenha uma função na regulação dessa mesma via de sinalização. A via PI3K/ Akt é regulada negativamente pela fosfatase PTEN que por sua vez contém dois resíduos de cisteína reativos que quando oxidados inibem a sua função. Desta maneira a depleção da proteína antioxidante anexina A2 pode estar associada com um aumento de stress oxidativo nas células H-Ras p36-4 que leva à inativação de PTEN e consequente sobre ativação da via PI3k/Akt.
A análise da expressão das proteínas do sistema antioxidante peroxirredoxina II, peroxirredoxina I-IV e tiorredoxina por western blotting permitiu constatar que as linhas celulares HT1080 e MDA-MB 231 H-Ras p36-4 quando comparadas com as HT1080 e MDA-MB 231 HRas p36-scramble mostram um aumento na expressão da proteína do sistema antioxidante - peroxirredoxina II (Figura 4.4). Este efeito só é visível nas células a sobre expressar H-Ras e com knockdown para a anexina A2, pelo que na comparação
45 das células HT1080 e MDA-MB 231 pBABE p36-4, respetivos controlos e HT1080 e MDA- MB 231 H-Ras p36-scramble, não existem diferenças na expressão proteica.
A família das peroxirredoxinas é descrita pela literatura (Hall, Karplus, & Poole, 2009; Rhee, Kang, Chang, Jeong, & Kim, 2001) como peroxidases, pelo que controlam a concentração de H2O2. A peroxirredoxina II apresenta semelhanças com a anexina A2 e
tal como esta, possui na sua constituição não um, mas dois resíduos de cisteína reativos que quando oxidados pela molécula de H2O2, são posteriormente reduzidos pela
tiorredoxina o que permite a redução de várias moléculas de H2O2. Devido ao modo de
ação semelhante entre as proteínas, o resultado obtido sugere que, para contrabalançar a depleção de anexina A2 e equilibrar o nível redox existe um aumento na expressão de peroxirredoxina II.
5.2 - Análise da estabilidade proteica e do mRNA
Ensaios com ciclohexamida e actinomicina D
Devido aos resultados obtidos nos ensaios anteriores em que foi verificado o aumento da expressão de HRas e da peroxirredoxina II nas células com depleção de anexina A2, procederam-se aos ensaios com ciclohexamida e actinomicina D para determinar uma possível causa desse aumento podendo este dever-se a vários fatores, entre os quais um aumento estabilidade proteica e/ou da estabilidade do mRNA.
A partir dos resultados obtidos da análise da estabilidade proteica (figura 4.5) em que as células foram submetidas a tratamento com ciclohexamida durante um curso de tempo (time course) verificou-se o aumento da estabilidade da proteína Ras nas células HT1080 com knockdown para a anexina A2.
Observou-se também o aumento da estabilidade de peroxirredoxina II nas células H-Ras p36 shRNA4, comparativamente com as restantes linhas celulares estudadas. Estes resultados são válidos para as células, MDA-MB 231 e HT1080.
A partir destes resultados concluiu-se que o aumento da expressão de H-Ras e peroxirredoxina II nas células H-Ras p36-4 é devido a um aumento na estabilidade destas proteínas.
46 Relativamente ao ensaio com actinomicina D (figura 4.6) não foram verificadas diferenças significativas, contudo, no futuro, para investigar se existe ou não alteração ao nível da transcrição dos genes da peroxiredoxina II e Ras deveria submeter-se o mRNA das mesmas linhas celulares ao método de PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) que devido à alta sensibilidade desta técnica, permite a quantificação de transcritos raros bem como de pequenas mudanças na transcrição dos genes.
5.3 - Ensaio de viabilidade celular – MTT
Os resultados referentes ao ensaio de viabilidade celular (figura 4.7), não evidenciam diferenças significativas entre as células pBABE e H-Ras. Contudo, quando são comparadas as linhas celulares H-Ras e pBABE p36-4 a diferença já é bastante significativa (P= 0,000549***), pelo que existe um aumento no número de células, o mesmo resultado foi obtido entre a comparação das linhas celulares H-Ras p36-4 e p36-
scramble (P=0,00159 **).
O aumento no número de células vai de encontro com os resultados obtidos nos ensaios das vias de sinalização, proteínas do sistema antioxidante e medição de ERO. A sobre- expressão de Ras e knockdown da anexina A2 originou, como demonstrado, o aumento da expressão da via mitótica MAPK/ERK, da via anti-apoptótica PI3-K/AKT, e consequentemente contribuiu também para o aumento da concentração de ERO. Para além disso, verificou-se também o aumento da expressão da proteína do sistema antioxidante peroxirredoxina II. Todos os resultados acima descritos são em prole do aumento da sobrevivência e proliferação celular, apoiando os resultados obtidos no ensaio MTT.
Contudo, pode também dever-se à área limitante da placa onde foi efetuado o ensaio. A linha celular utilizada só prolifera se estiver aderente à superfície da placa e no caso da concentração celular utilizada ser demasiado elevada, a área pode ser um fator limitante. Apesar de permitir a aderência celular, não irá permitir a sua proliferação. No futuro este ensaio deverá ser repetido com concentrações celulares mais baixas para permitir uma melhor análise e reprodutibilidade.
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5.4 - Medição da concentração de ERO
Começando por comparar apenas as linhas pBABE p36-3, p36-4 e p36 scramble, não se observam diferenças significativas entre elas. Colocando em comparação as linhas celulares pBABE e H-Ras o resultado é outro completamente diferente, apresentando uma muito maior produção de ERO nas células H-Ras, conforme o esperado devido à sobre-expressão de H-Ras.
Comparando as pBABE e H-Ras p36-3, estas últimas, apresentam uma maior produção de ERO. As pBABE e H-Ras p36-4 apresentam níveis de produção praticamente iguais.
As diferenças significativas obtidas nos níveis de produção de ERO nas linhas celulares H-Ras p36-3 e p36-4 podem dever-se à eficiência do knockdown da anexina A2. Em ambas as linhas existe expressão de anexina A2, contudo, nas células H-Ras p36-3 a depleção e consequente eficácia do knockdown é inferior quando comparada com as H- Ras p36-4 onde a depleção é superior.
Com base nos ensaios e resultados anteriormente obtidos em que se observou um aumento da expressão da peroxirredoxina II em células depletadas de anexina A2, nomeadamente nas H-Ras p36-4, sugere-se então que o mesmo mecanismo aqui atue na eliminação de ERO para manter o equilibro redox. Este resultado explica também, o porquê dos níveis semelhantes de ERO verificados nas células H-Ras p36-4 quando comparadas com pBABE p36-4.
Na linha celular H-Ras p36-3 não se verificou, mesmo na depleção de anexina A2, a sobre-expressão de peroxirredoxina II, o que pode explicar a diferença entre os resultados. Nestas células depletadas de anexina A2, parece não haver compensação por parte do sistema antioxidante o que consequentemente eleva os níveis de ERO.
Apesar dos efeitos pró-proliferativos das ERO, são apenas necessárias pequenas quantidades para induzir a proliferação. Em grandes quantidades, colocam a célula em stress oxidativo, o que promove a senescência e consequente morte celular. É necessário e essencial que as células consigam manter os níveis de ERO dentro de
48 valores ideais pelo que estes resultados evidenciam a necessidade da expressão de proteínas do sistema antioxidante pelas células cancerígenas e não cancerígenas.
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6 - Conclusões
Os resultados obtidos neste trabalho evidenciaram uma vez mais a função antioxidante já descrita para a anexina A2 deste vez com linhas celulares a sobre-expressar Ras oncogénico.
Identificou-se pela primeira vez que devido ao knockdown de anexina A2 e sobre- expressão de HRas, e consequente aumento dos níveis intracelulares de ERO, a célula necessita de reestabelecer os seus níveis redox e para tal aumenta a expressão de outra proteína do sistema antioxidante, nomeadamente da peroxiredoxina II.
Como já descrito pela literatura demonstrou-se também que a sobre-expressão de HRas leva ao aumento da expressão de vias de sinalização celular situadas a jusante nomeadamente as vias PI3-k/Akt e MAPK/ERK 1/2 que estão envolvidas em processos de proliferação celular e de sobrevivência. As consequências dos efeitos causados pelo aumento da expressão dessas mesmas vias são comprovados pelo aumento no número de células no ensaio de viabilidade celular nas linhas em que existe a sobre-expressão de HRas.
Conclui-se também que para além dos efeitos ao nível da viabilidade celular, a sobre- expressão de H-Ras acarreta também consequências para o aumento dos níveis de ERO, especialmente nas células H-Ras p36-3 em que não se verifica o aumento da expressão de peroxirredoxina II.
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7 - Perspetivas Futuras
Os resultados obtidos demonstraram um aumento na expressão e estabilidade das proteínas H-Ras e peroxirredoxina II em células depletadas de anexina A2, bem como um aumento na ativação das vias de sinalização ativadas por H-Ras, MAPK/ERK e PI3- K/Akt.
Os western blotting das células HT1080 demonstram que a expressão de H-Ras é ligeiramente mais elevada nas células depletadas de anexina A2, contudo não se sabe se existe uma interação direta ou indireta entre as duas proteínas pelo que no futuro se deveriam realizar ensaios de co-imunoprecipitação.
O aumento da expressão de H-Ras em células depletadas de anexina A2 foi apenas verificado nas células HT1080 e não nas MDA-MB 231. Estas células são de diferentes origens, as HT1080 são células mesenquimais enquanto que as MDA-MB 231 são epiteliais, pelo que seria interessante estudar as diferenças celulares para identificar a origem dos diferentes fenótipos.
Os ensaios com actinomicina D não demonstraram alteração significativas na estabilidade do mRNA. Contudo no ensaio com cicloheximida as diferenças observadas na estabilidade da peroxirredoxina II não foram muito significativas. O que sugere que esteja haver um aumento na transcrição do mRNA, pelo que no futuro se deveria realizar método de PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) de modo a verificar a transcrição do gene da peroxirredoxina II.
Quanto aos ensaios de viabilidade (MTT) apesar de evidenciarem as diferenças entre as linhas celulares a sobre-expressar H-Ras e as controlo e estarem de acordo com os restantes resultados, é necessário realizá-los novamente utilizando concentrações celulares mais baixas de modo a otimizar a análise e os resultados obtidos.
As medições de ERO demonstram como se previa, uma maior concentração nas células a sobre-expressar H-Ras, tendo-se observado também um comportamento semelhante entre a anexina A2 e a peroxirredoxina II na eliminação de ERO o que sugere outro possível estudo sobre as diferenças e semelhanças entre as proteínas do sistema antioxidante.
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