The reproduction of territoriality

Para determinação do conteúdo de LIC associado às nanocápsulas foi desenvolvida e validade uma metodologia analítica para quantificação deste novo analito em formulações nanoestruturadas. A validação de um método,

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através de estudos experimentais, deve garantir que o método analítico empregado atenda às exigências das aplicações analíticas, assegurando a qualidade e a confiabilidade dos resultados (Kano, 2002). Os parâmetros de especificidade, linearidade, precisão, exatidão, e limites de detecção e quantificação foram determinados de acordo com a conforme a Resolução 899 (Brasil, 2003).

Um método baseado em espectrometria no UV para determinação do teor da lactona sesquiterpênica licnofolida (LIC) em uma amostra de concentração de LIC desconhecida, foi desenvolvido e validado baseado no doseamento por espectrometria no UV em comprimento de onda de 265nm (espectrofotômetro Helios α, ThermoSpectronic, EUA). Não há método similar descrito na literatura. Acetonitrila grau CLAE (Merck) foi utilizada como solvente para diluição da LIC.

Um segundo método baseado na análise por CLAE utilizou-se cromatógrafo líquido de alta eficiência (Waters Alliance) equipado com bomba Waters 2695 e injetor Waters 2695 com o loop da válvula de tamanho de 20 µL. O comprimento de onda para quantificação da LIC foi determinado por detector espectrofotométrico de arranjo de foto-diodos (DAD) no espectro UV, em 265 nm de acordo com Santos et al.(2003).

Para o desenvolvimento do método utilizou-se uma coluna cromatográfica C18 Phenomenex®, modelo Gemini (150 x 4,6mm d.i.; 5 µm),

pré-coluna C18 Phenomenex® modelo AJ0-4287 C18 (4 x 3,0 mm) com fase

móvel constituída por uma mistura MeOH: água (60:40 v/v) com eluição isocrática, fluxo de 0,8 mL/min., volume de injeção de 20 µLe temperatura de 25ºC. Foi utilizada água MilliQ e MeOH grau CLAE (Merck). Todos os solventes foram filtrados através de membrana Millipore® de acetato de celulose de 47 mm de diâmetro e poro de 0,22 µm desgaseificado em banho de ultrassom por 30 minutos. Os dados foram obtidos utilizando o programa CLASS-VP, através da área dos picos detectados.

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3.3.3.1 Preparação da solução estoque e diluída de LIC

Inicialmente foi preparada uma solução de LIC na concentração de 1,0 mg/mL. Uma alíquota de 1,25 mL da solução obtida foi transferida para um balão volumétrico de 50,0 mL e o volume ajustado para 50,0 mL com ACN, resultando em uma solução de 25 µg/mL tanto para análise espectrofotométrica por UV quanto para análise cromatográfica. Estas soluções foram mantidas à temperatura de 8°C.

3.3.3.2 Especificidade

É a capacidade que o método possui de medir exatamente um composto em presença de outros componentes, tais como impurezas, produtos de degradação e componentes da matriz (Causon, 1997)

Uma solução contendo NC-B outra contendo LIC foram preparadas por dissolução em ACN (itens 1 e 2). Essas soluções foram injetadas no CLAE e os cromatogramas foram comparados para avaliar possíveis picos interferentes. Para a análise espectrofotométrica, o espectro no UV de ambas as soluções foi analisado em 265nm para avaliar a presença de possíveis interferentes. Foram preparadas as seguintes soluções:

1. Uma solução diluída de LIC em ACN misturada com NC-B na concentração de 25 µg/mL.

2. Uma solução de NC-B (sem LIC) na concentração de 25 µg/mL, obtida a partir de uma solução estoque a 1 mg/mL.

3.3.3.3 Linearidade

A linearidade indica a faixa de concentração do fármaco em que as respostas obtidas pela metodologia são diretamente proporcionais à quantidade de fármaco presente na amostra (United States Pharmacopeia, 2007). A equação da reta é obtida por regressão linear, através do método dos mínimos quadrados (Brasil, 2003)

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Foi demonstrada através da construção da curva de calibração, que representa a relação entre a resposta do instrumento e a concentração conhecida do analito (Brasil, 2003). A equação da reta foi obtida por regressão linear, através do método dos mínimos quadrados (Brasil, 2003). A avaliação da linearidade foi realizada por meio da construção de três curvas de calibração, em diferentes dias, a partir de solução estoque contendo 1mg/mL de LIC em ACN. Para análise espectrofotométrica no UV alíquotas desta solução estoque foram diluídas em ACN a fim de se obter sete diferentes concentrações de LIC correspondentes a 5,0; 7,5; 10,0; 15,0; 25,0; 35,0; 40; 0 µg /mL.

Para a técnica de CLAE preparou-se oito diferentes concentrações de LIC correspondentes a 2,0; 3,0; 4,0; 7,5; 10,0; 15,0; 20,0 e 25,0 µg/mL. Curvas de calibração com concentração versus área do pico ou absorbância foram plotadas para cada método e os dados obtidos submetidos à análise de regressão usando o método de mínimos quadrados. A linearidade foi expressa como coeficiente de correlação (R2) cujo valor deve ser ≥ 0,99.

3.3.3.4 Precisão

A precisão de um método analítico representa o grau de concordância dos resultados obtidos quando um procedimento analítico é aplicado repetidamente à mesma amostra (United States Pharmacopeia, 2007), sendo expressa como coeficiente de variação (CV) ou desvio padrão relativo (RSD) dessas medidas. A precisão intra-dia refere-se ao CV obtido por repetição do método com o mesmo analista, utilizando o mesmo equipamento e os mesmos reagentes, em curto intervalo de tempo (por exemplo, no mesmo dia). A precisão inter dia é obtida por meio de alteração de condições, como mudança de analistas ou reagentes e utilização do método durante várias semanas ou meses (Causon, 1997).

Este parâmetro foi determinado utilizando solução de LIC em três concentrações diferentes e em cinco réplicas no mesmo dia (precisão intra-dia) e em dias consecutivos (precisão inter-dias), e foi calculado segundo a

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CV ou RSD (%) = DP ×100 Cmédia

na qual,

RSD (%) = desvio padrão relativo

CV (%) = coeficiente de variação em porcentagem DP = desvio padrão

Cmédia = concentração média determinada

A precisão intra-dia foi avaliada em réplicas de cinco, analisando-se três diferentes concentrações, baixa (7,5 e 3,0 µg/mL de LIC para espectrofotometria no UV e CLAE, respectivamente), média (15,0 e 10 µg/mL de LIC para espectrofotometria no UV e CLAE, respectivamente) e alta (35,0 e 20 µg/mL de LIC para espectrofotometria no UV e CLAE, respectivamente). A precisão inter dia foi avaliada em 2 dias consecutivos e procedeu-se da mesma maneira como descrito para intra dia. Os resultados foram expressos pelo CV ou RSD dos resultados destas análises, conforme equação acima os quais devem apresentar níveis de variação <5%.

3.3.3.5 Exatidão

A exatidão é definida como a proximidade entre os resultados obtidos, utilizando-se o método proposto e o valor real, podendo ser expressa em termos de porcentagem de recuperação (United States Pharmacopeia, 2007). Neste caso, a exatidão é expressa como porcentagem recuperada. A avaliação da exatidão como porcentagem recuperada pode indicar possíveis interferências de excipientes da formulação. As amostras devem ser preparadas adicionando-se a solução do padrão da substância à matriz em que se pretende analisar.

A exatidão intra e inter-dias foram avaliadas pelo método de CLAE através de um teste de recuperação realizado em réplicas de cinco, em três diferentes concentrações. NC-B de PCL foram contaminadas com concentrações conhecidas de LIC: 3,0, 10,0, 20,0 µg/mL. Para análise de CLAE foram injetadas em triplicata amostras de NC contaminadas com as soluções LIC: 3, 0, 10, 0, 20,0 µg/mL. A análise por espectrofotometria no UV

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procedeu-se da mesma maneira nas concentrações, 7,5, 15,0, 35,0 µg/mL. A variação dos resultados deve ser 100% ± 5%.

As porcentagens de recuperação foram calculadas conforme a equação 2 :

R(%)= CNC - BNC S LIC na qual: R % = Porcentagem de recuperação CNC = nanocápsulas contaminadas BNC = nanocápsulas brancas

SLIC = soluções de LIC

3.3.3.6 Limites de detecção (LD) e quantificação inferior (LQI):

O limite de detecção (LD) representa a menor concentração da substância em exame que pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada, utilizando um determinado procedimento experimental (Brasil, 2003). O limite de quantificação inferior (LQI) deve representar a menor concentração que pode ser determinada com exatidão e precisão aceitáveis sob as condições experimentais estabelecidas. (Brasil, 2003).

As soluções diluídas de LIC foram preparadas e analisadas por ambos os métodos (cromatográfico e espectrofotométrico) em concentrações decrescentes no intervalo de 0,025-5,0 µg/mL e 0,05-5,0 µg/mL para CLAE e UV , respectivamente.

Para ambos os métodos o limite de detecção (LD) foi estabelecido por meio da análise de soluções de 5 réplicas de concentrações conhecidas e decrescentes do fármaco, até o menor nível detectável sendo calculado pela

equação 3 LD= DPa x3 IC na qual, Equação 2 Equação 3

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DPa = desvio padrão do intercepto com o eixo do Y de, no mínimo, 3 curvas de calibração construídas contendo concentrações do fármaco próximas ao suposto limite de quantificação;

IC = inclinação da curva de calibração.

Para ambos os métodos o limite de quantificação inferior (LQI) foi investigado utilizando-se cinco repetições (n=5) de concentrações decrescentes e conhecidas de LIC até o menor nível determinável, com precisão e exatidão aceitáveis. O limite de quantificação foi calculado através da fórmula matemática preconizada pela resolução 899 por Brasil (2003)

LQ= DPa x10 IC

A análise estatística dos resultados obtidos pelos métodos cromatográfico e espectrofotométrico foi feita pelo teste “t” de Student. As diferenças foram consideradas como significativas quando o nível de significância foi menor ou igual a 0,05 (P ≤ 0,05).