2 T EORETISK TILNÆRMING
2.3 Rensetiltak og forbedringspotensial
carcinoma cervical invasor (conização, histerectomia, Wertheim-Meigs).
6.3.3 – Critérios de Exclusão
Grupo 1 (Controle):
1. Mulheres com citologia cervical ou colposcopia anormal.
2. Todos os casos em que havia a presença de lesão pré-neoplásica cervical (lesões intraepiteliais escamosas de alto e baixo grau).
3. Mulheres que foram submetidas no passado a algum tratamento antineoplásico (radioterapia ou quimioterapia) para qualquer tipo de neoplasia.
Grupo 2 (NIC 3):
1. Os casos de NIC 3 associados a uma lesão invasiva ou micro-invasiva.
Grupo 3 (Carcinoma Invasor):
1. Os casos de carcinoma cervical cujo sítio primário da lesão era duvidoso, com a possibilidade de tratar-se de um carcinoma endometrial ou de um órgão contíguo (bexiga, reto) com invasão cervical.
2. Os casos de carcinoma cervical previamente tratados com radio e / ou quimioterapia.
6.4 - Variáveis e Categorias
6.4.1 - Variável Dependente
Diagnóstico Histológico (De Palo, 1993; Stávele, 1995; Hendrickson & Kempson, 1997; Griffiths et al, 1997)
O diagnóstico histológico do tecido cervical foi dividido em 3 categorias:
6.4.1.1 - Tecido Cervical Normal
Constituído por dois tipos de epitélio, o escamoso e o colunar. A ectocérvice é revestida pelo epitélio escamoso pluriestratificado não queratinizado semelhante ao da vagina, originado dos ductos de Müller, formado por quatro estratos.
O estrato mais profundo é a camada basal ou germinativa, que corresponde citologicamente às células basais internas. É formada por uma fileira única de células cúbicas dispostas perpendicularmente à membrana basal que a separa do estroma. Essas
células são pequenas e tem um grande núcleo hipercromático redondo ou oval que ocupa a maior parte da célula. Nessas células podem-se observar mitoses.
O estrato espinhoso ou camada parabasal é formado por várias camadas de células redondas ou ligeiramente poliédricas com núcleo redondo ou oval relativamente volumoso.
O estrato espinhoso superficial ou camada intermediária é composta por uma fila de células fusiformes com núcleo pequeno, claro, vesiculoso e citoplasma claro, freqüentemente preenchido por vacúolos.
O estrato superficial é formada por grande células planas com núcleo picnótico. O citoplasma dessas células contém quantidade variável de queratina.
O canal endocervical ou endocérvice é revestido por um epitélio simples, constituído por uma única fileira de células cilíndricas altas, mucíparas, dispostas em paliçada, sendo a maioria não ciliada (epitélio cilíndrico ou colunar). O núcleo oval é situado no terço inferior da célula. O citoplasma é abundante e vacuolizado.
Ao nível da zona de transformação e do canal endocervical existem pequenas células cubóides com núcleo redondo, volumoso e citoplasma escasso, não organizadas em camadas, agrupadas entre as células cilíndricas e a membrana basal. Essas são as células de reserva ou subcilíndricas.
O terceiro epitélio, denominado pavimentoso metaplásico, se interpõe entre o epitélio pavimentoso e cilíndrico e constitui um tecido de substituição do epitélio cilíndrico pelo pavimentoso pelas células de reserva.
6.4.1.2 – Neoplasia Intraepitelial Cervical Grau 3 (NIC 3)
Alterações nucleares (atipias, hipercromasia) em células epiteliais imaturas evidentes em toda a extensão do epitélio. O núcleo, geralmente circundado por citoplasma escasso, apresenta geralmente um aspecto florido com membrana nuclear acentuadamente espessada e irregular. Às vezes a cromatina se apresenta disposta em grandes conglomerados.
O epitélio apresenta-se alterado em mais de 2/3 da sua espessura, com mitoses típicas e atípicas, presentes também nas camadas superficiais (superficialização da atividade mitótica) e com perda da polaridade dos seus elementos.
6.4.1.3 - Carcinoma Cervical
Caracterizou-se por uma proliferação desordenada das células epiteliais com desarranjo arquitetônico associado a atipia nuclear que ultrapassam a membrana basal. Quando estas alterações ocorrem no epitélio pavimentoso, denominamos de carcinoma epidermóide ou escamoso e quando no epitélio glandular de adenocarcinoma.
6.4.2 - Variável Independente
6.4.2.1- Polimorfismo do Gene FAS
A presença deste polimorfismo foi determinada utilizando a técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e Enzima de Restrição (RFLP) descrita com detalhes nos Procedimentos.
Esta variável foi dividida em 3 categorias, de acordo com os genótipos observados na região correspondente a 331 pares de bases na eletroforese em gel de agarose, após digestão pela enzima de restrição Mva1:
Homozigoto Selvagem (AA): Observa-se duas bandas (uma com 233 e outra com 98 pares de bases) na eletroforese em gel de agarose. Considerado menos associado às doenças.
Heterozigoto (AG): A origem dos alelos é diferente. Observa-se quatro bandas (233, 189, 98 e 44 pares de bases). Considerado o mais associado às doenças.
Homozigoto Mutante (GG): O genótipo AA é mutado para GG, resultando em três bandas (189, 98, 44) na eletroforese em agarose.
6.4.3 - Variáveis de Controle
6.4.3.1- Idade
Variável contínua que posteriormente foi dividida em 2 categorias.
Pacientes com idade < 50 anos: definido como as pacientes com idade inferior ou igual a 50 anos e 364 dias no dia da coleta da amostra.
Pacientes com idade > 50 anos: definido como pacientes com idade superior ou igual a 51 anos no dia da coleta da amostra.
As mulheres foram divididas nestas duas categorias de idade como uma medida aproximada do status menopausal, uma vez que esta informação exata não se tinha de todas as mulheres. A idade média da menopausa nas mulheres brasileiras está por volta dos 50 anos (Ferreira, 1999). A seleção de qualquer idade específica como ponto de corte para a menopausa é arbitrária, pois ela não ocorre na mesma época em todas as mulheres, mas um período semelhante para a maioria das mulheres é uma alternativa.
6.4.3.2 – Etnia
Quanto à variável etnia, as mulheres foram classificada em 3 categorias: Branca
Negra Amarela
6.4.3.3 - Tipo Histológico
(
De Palo, 1993; Ronnett et al, 2002; Hendrickson & Kempson, 1997; Griffiths et al, 1997; Bacchi et al, 1999;)
1. Carcinoma Epidermóide (Espinocelular)
O carcinoma espinocelular apresenta uma grande variação relacionada ao padrão de crescimento, tipo celular e grau de diferenciação. Alguns são extremamente diferenciados, produzindo ceratina, pérolas córneas e células com tonofibrilas, enquanto que outros são compostos por células epidermóides indiferenciadas. A classificação histológica destes tumores tem-se baseado no tipo celular e diferenciação tumoral.
Os carcinomas de grandes células queratinizantes são compostos de células pavimentosas que mostram queratinização citoplasmática, pontes intercelulares e pérolas de queratina.
Os carcinomas de grandes células não-queratinizantes podem conter áreas focais de queratinização, porém as “pérolas” de queratina não são características. Ocorre maior grau de atipia nuclear e atividade mitótica, do que nos carcinomas queratinizantes.
Os carcinomas de pequenas células não queratinizantes consistem de população monomórfica de células tumorais, com alto grau mitótico.
O carcinoma verrucoso é uma variante do carcinoma espinocelular. Diferencia-se deste pela sua forma frequentemene exofítica papilar e queratinizado e de padrão infiltrativo com alterações citológicas mínimas.
2. Adenocarcinoma
Nos adenocarcinomas encontramos vários padrões histológicos. As células neoplásicas formam glândulas de forma e tamanhos variados com brotamentos e ramificações que lembram o epitélio endocervical normal.
Os adenocarcinomas papilíferos do tipo viloglandular constituem uma forma especial de apresentação das neoplasias endocervicais. É constituído por células volumosas com núcleos vesiculosos e pouco irregulares, com nucléolo central e pouco evidente, havendo número baixo de mitoses.
O adencoarcinoma com diferenciação escamosa (adenoacantoma) é uma variedade bem diferenciada com focos de metaplasia escamosa sem atipia, enquanto que o carcinoma adenoescamoso caracteriza-se pela metaplasia escamosa maligna em um adenocarcinoma.
O carcinoma de células claras compõe-se de células com citoplasma claro (geralmente com abundante conteúdo citoplamático de glicogênio) e núcleos vesiculares. Os tumores exibem variedade de padrões, incluindo folhetos sólidos de células claras, túbulos, cistos e áreas papilares ou glandulares.
6.4.3.4 – Grau de Diferenciação Tumoral (FIGO, 2000)
O grau de diferenciação tumoral foi classificado de acordo com a revisão daFederação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia (FIGO) de 2000:
G1: Tumores de colo uterino bem diferenciado.
G2: Tumores de colo uterino moderadamente diferenciados. G3: Tumores de colo uterino pouco diferenciados.
G4: Tumores de colo uterino indiferenciados.
Com frequência os graus G3 e G4 são agrupados na mesma graduação (G3), entretanto, alguns Serviços de Anatomia Patológica, como os que utilizamos neste estudo, preferem a graduação em 4 níveis. Para o cálculo das estimativas de risco agrupamos os graus G1 e G2, considerados menos agressivos e os G3 e G4, considerados como mais agressivos.
6.5 - Procedimentos
Foram selecionados 214 blocos de parafina mais representativos de tecido cervical com carcinoma cervical e 75 de NIC 3, avaliados pelo Serviço de Anatomia Patológica do Hospital Universitário da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC) de Florianópolis/SC, Hospital do Câncer Alfredo Abraão de Campo Grande/MS e Hospital e Maternidade Leonor Mendes de Barros de São Paulo/SP. Os 225 controles foram avaliados através da análise de amostras de sangue de mulheres Hospital do Câncer Alfredo Abraão de Campo Grande/MS e Hospital São Paulo/Escola Paulista de Medicina (EPM) de São Paulo, armazenados no Laboratório de Biologia Molecular em Ginecologia da EPM . Os
dados referentes à idade, etnia, tipo histológico e grau de diferenciação tumoral foram coletados dos prontuários do Serviço de Arquivo Médico (SAME) dos referidos hospitais.
6.5.1 – Extração do DNA
6.5.1.1 – Bloco de Parafina (Técnica Formol/Clorofórmio)
Os blocos de parafina mais representativos foram selecionados para o estudo. Pequenos fragmentos de cada bloco foram colocados em frasco tipo Eppendorf de 2 ml contendo 1 ml de xilol. Este processo foi realizado três vezes, por um período de 10 minutos. A seguir este material foi agitado com velocidade de 200 rotações por minuto (rpm) a 37oC
durante 30 minutos. Cada frasco foi lavado com 1 ml de etanol absoluto duas vezes e posteriormente com 1 ml de etanol 50% e finalmente com 1 ml de água milliQ autoclavada. Entre cada processo de lavagem, os frascos foram agitados a 200 rpm a 37oC, durante 30
minutos e centrifugados a 13.000 rpm durante um minuto. O sobrenadante foi descartado. A seguir, foram adicionados 200 l de tampão de digestão com 10 l de proteinase K e aquecido a 37oC durante toda a noite ou por 48 horas. Este material foi centrifugado a
13.000 rpm durante 1 minuto. Ao sobrenadante foi adicionado igual volume do produto DNA GFX® e centrifugado a 13.000 rpm por 10 minutos. Os 200 l de sobrenadante foram
colocados em um novo frasco tipo Eppendorf de 1,5 ml e adicionado 950 l de etanol absoluto e 20 l de acetato de sódio 3M com ph 5,2. Esta solução foi mantida a -20oC por
24 horas e posteriormente centrifugada a 13.000 rpm por 20 minutos para formar o “pellet” de DNA. Esse resíduo foi lavado com etanol 80% e centrifugado a 13.000 rpm durante 2 minutos, por duas vezes. O resíduo deste processo foi secado a temperatura ambiente durante 10 minutos e rehidratado em 100 l de água milliQ autoclavada.
6.5.1.2 – Sangue (Técnica do Kit GFX®)
Para as amostras de sangue, o DNA genômico foi extraído segundo a técnica do Kit GFX® da Amersham-Pharmacia para células sanguineas. Foram utilizados 100 l de sangue
total, sendo adicionado 500 l da solução de extração e mantido em repouso por 5 minutos. A seguir o produto foi colocado na coluna de filtragem e centrifugado a 8.000 rpm durante um minuto. Adicionou-se 500 l da solução de lavagem e o produto foi centrifugado a 14.000 rpm por três minutos. Neste momento, foi adicionado 100 l de água milliQ autoclavada, pré- aquecida a 70 oC, seguida de centrifugação a 14.000 rpm durante um minuto em um novo
frasco tipo Eppendorf.
O DNA está pronto para ser utilizado em outras reações.
6.5.2 – Amplificação do DNA por PCR
Para a pesquisa do polimorfismo da região promotora (posição do nucleotídeo -670) do gene FAS foi utilizado a técnica descrita por Rudert et al (1995) e Wang et al (2003) com as seguintes seqüências inicializadoras (primers) que amplificam um fragmento de DNA: Forward:5’- CTA CCT AAG AGC TAT CTA CCG TTC – 3’ e Reverse: 5’ – GGC TGT CCA TGT TGT GGC TGC – 3’.
Uma solução de 25 l foi constituída por 1 l da mistura de primers, 2 l do DNA extraído, 12 l da solução Master Mix® (Promega) e 10 l de água. Esta solução foi
submetida ao termociclador (GeneAmp PCR System 9700TM, Applied Biosystems) a 94oC
por três minutos e a seguir por 40 ciclos, onde cada etapa de desnaturação do DNA foi de 94oC por um minuto, anelamento ou hibridização a 56oC por um minuto e polimerização ou
extensão a 72oC por um minuto. Finalmente, a solução foi aquecida a 72oC por sete minutos.
No processo de desnaturação ocorre a separação da “cadeia dupla” de DNA. A hibridização ocorre entre a cadeia original de DNA (agora desnaturada em “cadeia simples”) e a sequência de oligonucleotídeos (primers) que se liga à região inicial do DNA a ser amplificado, aumentando o número de cópias. A polimerização dá origem a cópias de nucleotídeos da matriz do DNA da amostra inicial, sendo ampliada a região limitada pelos dois extremos de ligação dos primers com a matriz de DNA. Assim, ao final de 40 ciclos, a
reação teve um número teórico máximo de 240 moléculas de DNA dupla fita, que são cópias
exatas da região específica do DNA molde que foi codificado pelos iniciadores.
Este produto foi submetido à eletroforese em gel de agarose 2% contendo brometo de etídio para checar se o padrão obtido nesta reação foi de 331 pares de bases para identificação do gene FAS (Fig. 5).
FIGURA 5: Fotografia de placa de eletroforese em gel de agarose 2% mostrando os produtos de PCR (331 pb). Obs: M: Marcador 100pb (controle positivo); Amostras 1-5: Amostras amplificadas com o FAS (331 pb); Amostra 6: Controle negativo
6.5.3 – Identificação do Polimorfismo do Gene FAS por Enzima de Restrição (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP)
A enzima de restrição Mva1 “corta” o DNA em sítios específicos do fragmento amplificado pelo processo de PCR.
Quando a mutação cria um novo sítio de restrição, os fragmentos originados serão menores que os fragmentos de DNA normal. Esses fragmentos serão separados pelo peso molecular através da eletroforese em gel de agarose 2%, cujas bandas serão visualizadas conforme sua origem (Adams et al, 1994).
O genótipo selvagem do gene FAS (AA) irá apresentar à eletroforese em gel de agarose duas bandas, uma com 233 pares de bases e outra com 98 pares.
331 pb
Nos casos de heterozigose (genótipo AG), no qual a origem dos alelos é diferente, o gene FAS se mostrará em quatro bandas, 233, 189, 98 e 44 pares de bases.
Quando o genótipo AA é mutado para GG (FAS mutado), este segmento é digerido pela enzima, resultando em três bandas com 189, 98 e 44 pares de bases.
Para todos os casos, isso irá ocorrer na região correspondente a 331 pares de bases.
O processo de identificação do polimorfismo se inicia com a fragmentação de uma aliquota de 10 l do produto do PCR pela enzima Mva1 (1 l), associado a 1 l de tampão durante cerca de 4 horas ou toda a noite a 37oC. Posteriormente 5 l desta solução foi
submetida à eletroforese (potência de 130-150 V e 118-120 MA) em gel de agarose 2% com o corante brometo de etídio por cerca de 25 minutos, classificando o gene FAS de acordo com os pares de bases identificados (Fig. 6).
FIGURA 6: Fotografia da placa de eletroforese em gel de agarose 2% mostrando os genótipos da região promotora do gene FAS na posição -670 por PCR-RFLP. M AA AG GG 233 pb 189 pb 98 pb 44 pb 233 pb 98 pb 233 pb 189 pb 98 pb 44 pb 189 pb 98 pb 44 pb
6.6 – Instrumento para Coleta de Dados (Protocolo)
I – DADOS DE IDENTIFICAÇÃO
No Prontuário: _______________________ No Identificação Pesquisa: ______________
Iniciais: ________________ Idade: ____________ anos Fone: ( ) _______________ Data Nascimento:________/________/______ Raça: _____________________________ Médico Responsável: ________________________________________________________