O parasito T. cruzi está constantemente exposto a fatores exógenos e consequentemente sofre danos em seu genoma. A diversidade da população está ligada à capacidade do parasito a tolerar esses danos em seu genoma, e juntamente, aos mecanismos de metabolismo do DNA são responsáveis por tolerar e reparar quaisquer danos causados em seu material genético, nuclear e mitocondrial. Além disso, tolerância às lesões, garantem a sobrevivência do parasito e a evolução da espécie (SILVA et al., 2016; WATERS et al., 2009).
O Trypanosoma cruzi é capaz de resistir a altas doses de radiação gama, suportando até 1,5 kGy. Como efeito biológico direto, a radiação gama causa a quebra de fita dupla no DNA por induzir radiólise da água e, portanto, altas doses de ER, principalmente ●OH . Porém, após 48 horas da irradiação, é possível visualizar as bandas cromossômicas, já reparadas. Durante o mecanismo de reparo, processos de tradução de proteínas são reprimidos, bem como a expressão de genes relacionada com o metabolismo basal. Após o período de 120 horas, a taxa de crescimento do parasito, volta a normalizar (GRYNBERG et al., 2012; VIEIRA et al., 2014).
As vias de reparo de DNA consistem em mecanismos que protegem a integridade do genoma para a sobrevivência do parasito durante o seu ciclo de vida, tanto do meio ambiente, quanto dentro das células de mamíferos, onde é necessário lidar com respostas de defesa celulares que normalmente envolvem ER e também de processos metabólicos endógenos (respiração celular, cadeia transportadora de elétrons) do próprio parasito (SCHAMBER- REIS et al., 2012).
No genoma dos tripanossomatídeos já forma identificados diferentes mecanismos de manutenção do DNA (nuclear e mitocondrial). Esse sistema de reparo engloba vias distintas responsáveis por remover classes distintas de danos ao DNA, como a via de reparo por excisão de bases (do inglês “Base Excision Repair” BER) que remove bases oxidadas, reparo
por excisão de nucleotídeos (do inglês “Nucleotide Excision Repair” NER) responsável pela
remoção de adutos distorcivos e reparo de pareamento errôneo (do inglês “mismatch repair”
(MMR)). O DNA não só é susceptível ao ataque de ER nas bases nitrogenadas mas também,
na estrutura de açúcar-fosfato produzindo rupturas de uma única fita (do inglês “single-
que podem ser reparados pelas vias de recombinação homóloga (HR) e junção de fitas não- homólogas (do inglês “Nonhomologous End Joining” (NHEJ)). Apesar de estes mecanismos
serem bastante eficientes na maioria das lesões de DNA, alguns danos permanecem e podem gerar mutações ou bloqueio da replicação (CERQUEIRA et al., 2017; PASSOS-SILVA et al., 2010).
O sequenciamento completo do genoma de T.cruzi, T. brucei e Leishmania major, contribuiu para o entendimento de muitos mecanismos biológicos da vida destes organismos, incluindo mecanismos de reparo de DNA e tolerância a danos. Um importante exemplo foi a confirmação da ausência de Mutt no T. cruzi, que codifica uma pyrofosfohidrolase que retira o pool de nucleotídeos oxidados, evitando mutações causadas por oxidação espontânea da guanina (EL-SAYED et al., 2005). No entanto, foi demonstrado que o T. cruzi codifica uma sequência homóloga de Mutt, chamada de TcMTH, capaz de complementar a deficiência de Mutt (SILVA et al., 2016).
1.5.1. Reparo por excisão de bases (BER)
A via de BER é a principal para o processamento de lesão que modificam bases individuais, mas não causam modificações grandes na estrutura da dupla hélice. Os processos responsáveis por essas modificações na fita são causadas por processos redox, alquilação e desaminação de bases, sendo a oxidação o principal fator endógeno de danos ao DNA (CERQUEIRA et al., 2017). No reparo por excisão de bases, a enzima DNA glicosilase reconhece a base nitrogenada modificada ou mal pareada e inicia o reparo, retirando a base e deixando um sítio abásico (sítio AP). A enzima endonuclease remove a porção açúcar-fosfato, ocorrendo a excisão do sítio abásico que é potencialmente citotóxico e mutagênico e o reparo é completado pela atividade da enzima fosfodiesterase. A DNA polimerase adiciona um novo nucleotídeo correspondente, e a DNA ligase une as bases nitrogenadas (figura 7)(CABRERA et al., 2011; FURTADO et al., 2012; PASSOS-SILVA et al., 2010).
Figura 7. Reparo por excisão de Bases. Esquema das etapas da via de BER, sendo inicialmente identificada a lesão na fita, a DNA glicosilase reconhece e retira a base modificada da fita, formando um sítio abásico. A endonuclease remove a porção açúcar-fosfato e a enzima fosfodiesterase completa a via. A DNA polimerase insere a base correta e a DNA ligase faz as ligações complementares na fita.
Dentre os quase 50 tipos identificados de lesões de base causadas por processos redox, a lesão da 8-oxoG é uma das mais abundantes e melhor caracterizada. A 8-oxoG é formada em grande quantidade pela reação de diferentes moléculas oxidantes, principalmente o radical
●OH e o oxigênio singlete, com o DNA (CADET et al., 2017; WHITE, 2016).
O reparo de 8-oxoG faz parte de um mecanismo de multi-defesa, o chamado sistema GO que compreende as enzimas responsáveis pelo reparo da 8-oxoG em eucariotos que são MTH1, MUTYH e OGG1. A enzima MTH1 (ou Mutt) hidrolisa a 8-oxo-dGTP no pool de nucleotídeos devolvendo-o para a forma monofosfato de modo que não seja incorporado no DNA por polimerases. A enzima OGG1 (ou MutM) e MUTYH (ou MutY) são responsáveis pela remoção da 8-oxoG emparelhado com a citosina no DNA ou removendo a adenina na 8- oxoG e a OGG1 impede a mutagênese por remoção de 8-oxoG, além de atuar no núcleo e nas
mitocôndrias. Caso essa oxidação da guanina não seja reparada, a 8-oxoG pode emparelhar com adenina e pode causar um pareamento transverso, sendo o ideal G:C e T:A. Quando a 8- oxoG é inserida na replicação do DNA pode ocorrer quebras de fita dupla, tornando essa lesão deletéria (AGUIAR et al., 2013; FURTADO et al., 2012).
Foi mostrado por (AGUIAR et al., 2013; CERQUEIRA et al., 2017) que a expressão heteróloga de MutT em T. cruzi aumenta a resistência do parasito ao estresse oxidativo, causado pelo H2O2.
1.5.2. Reparo por excisão de nucleotídeos (NER)
No reparo de DNA um dos principais mecanismos é o reparo de excisão de nucleotídeos - NER, sendo o mecanismo mais versátil para reparar lesões que modificam a conformação tridimensional do DNA, tais como adutos de cisplatina, lesões induzidas por radiação UV, (dímeros de pirimidinas) e alquilação de aldeídos longos (HOEIJMAKERS, 2009).
Esta via é controlada por duas sub vias principais: a primeira que atua em todo o genoma e na cadeia não transcrita de genes ativos, chamada de reparo global do genoma - GGR (do inglês “Global Genome Repair”), e a segunda via é a de reparo acoplado à transcrição - TCR (do inglês “Transcription-Coupled Repair”) que é ativada quando um
lesão ocorre em genes que estejam sendo transcritos, permitindo que a região transcrita de genes ativos, tenha maior prioridade para ser reparado do que o restante do genoma (HOEIJMAKERS, 2009)
O mecanismo GGR-NER passa por várias etapas no reparo, sendo que inicialmente ocorre a detecção da distorção na fita de DNA, realizado por XPC e HR23B ou pelo complexo DB1/XPE-DDB2. Após reconhecer a região, a enzima helicase XPB e XPD promove a abertura da hélice de DNA, separando em duas fitas simples pelo complexo TFIIH. Posteriormente, realiza o recrutamento de XPA, juntamente com as três subunidades de proteína A (RPA) de replicação heterotrimérica, com isso, o ocorre o corte do DNA pela endonuclease XPG (lado 3’ da lesão) e pelo heterodímero XPF-ERRC1 (lado 5' da lesão). A DNA polimerase é responsável por polimerizar uma nova fita de DNA e a enzima DNA ligase liga este segmento de DNA, pela ligase III ou pela ligase I (em células replicativas ativas)(figura 8) (COSTA et al., 2003; MORAES, 2012).
Figura 8. Reparo por excisão de Nucleotídeos. Esquema das etapas da via de NER, sendo inicialmente identificada a distorção na fita de DNA, a helicase realiza a abertura da fita na região danificada. A endonuclease cliva a porção de nucleotídeos e pelo heterodímero. A DNA polimerase sintetiza a fita de DNA complementar e a DNA ligase faz as ligações na fita.
O TCR-NER tem um mecanismo semelhante ao GGR-NER, mas difere nos passos iniciais de reconhecimentos das lesões, porque falta os complexos XPC e DDB1. O TCR- NER é ativado quando ocorre o bloqueio da RNA polimerase II, que posteriormente recruta CSA, CSB e XAB2. As seguintes etapas são realizadas pelo complexo TFIIH como no GGR (HOEIJMAKERS, 2009).
Apesar da sequência compartilhada pelas proteínas NER eucarióticas ser bastante conservada, nem todos os genes que codificam essas proteínas são encontrados entre os grupos filogenéticos distantes. No genoma dos tripanossomatídeos compreende a maioria dos elementos da via de NER. Em T. cruzi, por exemplo, XPB e DDB1 aparecem duplicadas, já outros como o XPA não foram identificados nos tripanossomatídeos. A etapa de ligação das
bases nas fitas é possível que sejam diferentes, pois os tripanossomatídeos não possuem a DNA ligase III, que junto com XRCC1 desempenham um papel importante na etapa final da via. Entretanto, como os seus genomas codificam a ligase I, pode ser possível que a etapa de ligação seja realizada exclusivamente por esta proteína nesses parasitos. Além de outras enzimas como DDB2, que interage com DDB1 e reconhece lesões induzidas por UV e RPA3, também não foram identificados no genoma dos tripanossomatídeos (PASSOS-SILVA et al., 2010).
Pesquisadores mostraram que em T. brucei o complexo TFIIH contém duas subunidades específicas (TSP1 e TSP2), que são indispensáveis para a viabilidade parasitária e transcrição do gene spliced leader (SL) (GÜNZL 2009). Essas subunidades também estão presentes nos genomas de T. cruzi e L. major. Essa característica pode implicar que o TCR poderia ser uma dos mecanismos mais importantes envolvidos no reparo de DNA nesses parasitos (LEE, 2009; MARTINEZ-CALVILLO et al., 2010).
Essa ausência de CSA, indica que TCR difere dos mecanismos utilizados no TCR dos eucariotos superiores. De acordo com Passos-Silva, a superexpressão da DNA polimerase ɳ (Polɳ) de T. cruzi, envolvida na síntese de translesão de dímeros de pirimidina e a superexpressão ou haploinsuficiência de RAD51, uma proteína chave em HR, não confere proteção contra radiação UV, o que poderia sugerir que as lesões induzidas por UV são reparadas antes da célula entrar na fase S. Juntamente com esses dados, acredita-se que em T.
cruzi as lesões que causam distorções de DNA são facilmente detectadas e reparadas por
TCR, pois a grande maioria dos genes são transcritos constitutivamente (PASSOS-SILVA et al., 2010).