3.7.1 Potencial aflatoxigênico das cepas de Aspergillus seção Flavi
3.7.1.1 Extração de aflatoxinas para realização de potencial aflatoxigênico
Um fragmento de cada colônia de Aspergillus seção Flavi, previamente isolado foi inoculado em meio ágar coco e incubado a temperatura de 25 °C por 15 dias (LIN e DIANESE, 1976). Após este período, o conjunto cultura e ágar foram pesados e o ágar foi tranferido para Erlenmeyer de capacidade de 500 mL e foi adicionado clorofórmio na proporção de 10 g do cultivo para 30 mL de clorofórmio e submetido a agitador mecânico horizontal durante 30 minutos. O homogeneizado foi filtrado em papel
de filtro contendo sulfato de sódio anidro e terra diatomácea e o filtrado foi evaporado até resíduo e armazenado a -4ºC até a realização de cromatografia.
3.7.1.2 Avaliação qualitativa do potencial aflatoxigênico
A avaliação qualitativa do potencial aflatoxigênico por cepas de Aspergillus spp. isoladas foi realizada por CCD.
Cada extrato extraído foi ressuspendido em 500 µL de clorofórmio, e imediatamente aplicada 10 µ L na cromatofolha (“TLC sílica gel 60”, Merck), com auxilio de micro-seringa. As cromatofolhas de sílica foram demarcadas com pontos de aplicação localizados 2 cm da base inferior, onde foram aplicadas as amostras com intervalos de 1 cm entre elas, bem como solução padrão das aflatoxinas B1, B2, G1 e G2. O diâmetro da aplicação das amostras foi sempre o menor possível a fim de evitar dispersão da toxina. Foi delimitada uma linha superior de 12 cm da base da placa, por meio de traço forte, para delimitar a fase móvel. A placa foi eluída unidimensionalmente com a utilização de 100 mL de fase-móvel composta de solução saturada de clorofórmio:acetona (9:1), no interior de cuba cromatográfica com tampa de vidro. Após a separação, as cromatofolhas foram submetidas à luz ultravioleta com comprimento de onda de 366 nm (TARIN et al., 2004), comparando as revelações das amostras com as do padrão de referência (Rf) (SOARES e RODRIGUES-AMAYA, 1989). As amostras que revelaram fluorescência de coloração verde indicaram a produção de aflatoxinas G’s, e as que revelaram fluorescência azul, produção de aflatoxinas B’s.
3.7.1.3 Avaliação quantitativa do potencial aflatoxigênico
A avaliação quantitativa do potencial aflatoxigênico das cepas de Aspergillus spp. isoladas foi realizada por CLAE de acordo com Lebret et al. (2004) e Tanaka et al. (2000) com modificações.
Cada amostra extraída foi ressuspendida em 2 mL de clorofórmio, e 100 µL desta solução foi transferida para frasco âmbar e seca até resíduo. A partir daí, a amostra foi ressuspedida em 3 mL de solução de acetonitrila:água (85:15), agitada em vórtex durante 1 minuto e então diluída em 27 mL de água acidificada (0,5 % ácido acético glacial) e novamente agitada. A partir desta solução foi realizada a extração em fase sólida, utilizando cartucho de sílica Strata C18-E 500 mg/3 mL, previamente condicionado por 3 mL de metanol grau HPLC e 6 mL de água acidificada 0,5 %. Esta solução foi
submetida completamente a fluxo de 1 gota/segundo, com auxilio de bomba a vácuo. Após esta etapa,
os cartuchos sofreram etapa de “clean up” (limpeza) com a adição de 12 mL de água acidificada e a
extração das aflatoxinas com eluição final em 1 mL de metanol grau CLAE. As amostras foram submetidas à secagem a resíduo, derivatizadas com 200 µL de hexano e 100 µL de TFA (ácido trifluoracético), e mantidas a 40 C por 15 minutos, após este as amostras foram secas a resíduo e ressupendidas em 2000 µL de solução metanol:água (1:1, v/v). Volume entre 1 e 50 µL da solução (dependendo da concentração da toxina) foi injetada no cromatógrafo líquido e as aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 presentes no extrato foram quantificadas, tendo como fase móvel água:acetonitrila:metanol (8:1,5:1,5 v/v/v) 0,1% TFA, fluxo de 1mL/min, e detector de fluorescência (365 nm de excitação e 450 nm de emissão).
3.7.2 Determinação de aflatoxinas nas amostras de castanha-do-brasil
A determinação de aflatoxinas nas amostras de castanha-do-brasil foi realizada por CLAE de acordo com Lebret et al. (2004) e Tanaka et al. (2000) com modificações. Para este fim, foi utilizado o cromatógrafo líquido modelo Prominence da marca Shimadzu, modelo LC 20, módulo CBM 20A, detector de fluorescência RF 10 AXL marca Shimadzu e loop fixo com capacidade de 20 µl, e injetor automático de 1 a 100 µl acoplado a coluna analítica (Shimadzu, Shin-Pak VP ODS 150 x 4,6 mm). Para análise dos resultados foi utilizado o programa LC Solution, Shimadzu.
3.7.2.1 Amêndoas
Total de 25 gramas de cada amostra de amêndoa foi homogeneizada e triturada. Alíquota de 2,5 g de cada amostra foi separada, então, adicionada 12,5 mL de solução acetonitrila:água (85:15 v/v) e submetida a vórtex e, posteriormente, a agitador mecânico horizontal durante 60 minutos. O homogeneizado foi centrifugado a 10.000 rpm durante 3 minutos. Cinco mililitros do sobrenadante foram, então, transferidos para tubo de polipropileno de capacidade de 50 mL e adicionado de 45 ml de água acidificada e agitado vigorosamente. A partir desta solução foi realizada a extração em fase sólida, utilizando cartucho de sílica Strata C18-E 500 mg/3 mL, previamente condicionado por 3 mL de metanol grau CLAE e 6 mL de água acidificada. Esta solução foi submetida completamente a fluxo de
up” (limpeza) com a adição de 12 mL de água acidificada 0,5 % e, extração das aflatoxinas com eluição final em 1 mL de metanol grau CLAE. As amostras foram secas, derivatizadas, submetidas à nova secagem a resíduo e ressupendidas em 400 µL de solução metanol:água (1:1, v/v).
Quarenta microlitos da solução foram injetados em cromatógrafo líquido Shimadzu Prominence (Kyoto, Japan) equipado com detector de fluorescência RF 10 AXL com comprimentos de onda de excitação, 365 nm; e de emissão: 450 nm e sistema de injeção automática. A coluna analítica (Shimadzu, Shim-Pack VP ODS, 150 x 4.6 mm) estava acoplada em cartucho de pré-coluna (Shim- Pack GVP-ODS, 10 mm x 4.6 mm) mantida a 40 oC em forno. A fase móvel isocrática consistia de solução de água:acetonitrila:methanol (8:1,5:1,5 v/v/v) 0,1 % TFA, fluxo de 1 mL/min.
3.7.2.2 Cascas e Ouriços
Total de 25 gramas de cada amostra foi homogeneizada e triturada. Alíquota de 5 g de cada foi separada, então, adicionada 12,5 mL de solução acetonitrila:água (85:15 v/v), submetida a vórtex e posteriormente a agitador mecânico horizontal durante 60 minutos. O homogeneizado foi centrifugado a 10.000 rpm durante 3 minutos. Dois e meio mililitros do sobrenadante foi, então, transferido para tubo de polipropileno de capacidade de 50 mL e adicionado de 47,5 ml de água acidificada e agitado vigorosamente. A partir desta solução foi realizada a extração em fase sólida, utilizando cartucho de sílica Strata C18-E 500 mg/3 mL, previamente condicionado por 3 mL de metanol grau CLAE e 6 mL de água acidificada. Esta solução foi submetida completamente a fluxo de 1 gota/segundo, com auxilio
de bomba a vácuo. Após esta etapa, os cartuchos sofreram etapa de “clean up” com a adição de 12 mL
de água acidificada e extração das aflatoxinas com eluição final em 1 mL de metanol grau CLAE. As amostras foram submetidas à secagem a resíduo, derivatizadas, secadas novamente e ressupendidas em 400 µL de solução metanol:água (1:1, v/v).
Vinte microlitos da solução foram injetadas no cromatógrafo líquido Shimadzu Prominence (Kyoto, Japan) equipado com detector de fluorescência RF 10 AXL com comprimentos de onda de excitação, 365 nm; e de emissão: 450 nm e sistema de injeção automática. A coluna analítica (Shimadzu, Shim-Pack VP ODS, 150 x 4.6 mm) estava acoplada em cartucho de pré-coluna (Shim- Pack GVP-ODS, 10 mm x 4.6 mm) mantida a 40 oC em forno. A fase móvel isocrática consistia de solução de água:acetonitrila:methanol (8:1,5:1,5 v/v/v) 0,1 % TFA, fluxo de 1 mL/min.
3.7.3 Determinação de ácido ciclopiazónico nas amostras de castanha-do-brasil
A determinação de ACP nas amostras de castanha-do-brasil (ouriço, casca e amêndoa) foi baseada em Urano et al. (1992a).
Vinte e cinco gramas de cada amostra, previamente homogeneizada e triturada, foram aliquotadas em 2,5 g e transferidas tubo de polipropileno com capacidade para 25 mL e acrescidos de 20 mL de solução de metanol:bicarbonato de sódio 2 % em água (7:3). Após agitação por 45 minutos em agitador mecânico horizontal, as amostras foram centrifugadas a 10.000 rpm durante 3 minutos. Oito mililitros do sobrenadante foram transferidos para funil de separação e adicionados de 10 mL de hexano. Em seguida, foi recolhida a fase inferior e acrescida de 8 mL de KCl 10%. A solução foi acidificada com HCl 6N até obtenção de pH=3. Foram então, realizadas duas partições com 10 mL de clorofórmio, visando concentração da amostra. Os extratos foram submetidos à secagem e ressuspendidos em 1.000 µL de metanol grau CLAE e injetados em cromatógrafo líquido Shimadzu Prominence HPLC system equipado com detector UV-Vis (ultravioleta visível) Shimadzu SPD-10A com comprimento de onda a 282 nm, em sistema de injeção automática e coluna Luna C-8 (4.6 x 250 mm, 5-µm de tamanho de partícula; Phenomenex, Torrance, CA, USA) mantido a 40 oC em forno. A fase móvel isocrática consistiu de 4 mM de ZnSO4 em solução de metanol:água (6:4, v/v) e foi eluída a um fluxo constante de 1 mL/min.