4 Methodology
4.4 Quality criteria
Os espectros FTIR das lenhinas foram obtidos num espectrómetro Mattson 5000 usando pastilhas de KBr, obtidas com 0,5 mg de lenhina e 250 mg de KBr. Todos os espectros foram adquiridos com uma janela espectral de 401 cm-1 a 3998 cm-1 e com uma resolução de 2 cm-1, o q
tidos em ficheiros de texto, e normalizados para a absorção correspondente às vibrações do anel aromático, em 1510 cm-1. Os valores de transmitâncias foram convertidos para absorvâncias e estes foram submetidos à análise de componentes principais usando 2 programas compilados em linguagem FORTRAN, nomeadamente BIOTEC e FAEN, desenvolvidos no Laboratório do Departamento de Biotecnologia, Faenquil, Faculdade de Engenharia Química de Lorena, Brasil, baseado no trabalho de Scarm
método da oxidação da lenhin e potás
is que culminam com a análise afia gasosa/espectrometria d
omo referido em I.5.3.2.2. Usou-s mente com alterações pontua 1
A etapa de metilação decorreu num balão de fundo redondo de 50 mL com 3 tubuladuras, colocado sobre uma placa de agitação magnética. Nele foram colocados 100 mL da amostra de lenhina que se suspenderam em 10 mL de uma solução de 1,2- dimetoxietano/me
o
inerte a atmosfera de trabalho. Nas conexões e vedações do sistema foram utilizados parafil e teflon. Iniciou-s
pressão
ndo-se mantido o pH reaccional sempre acima de 11, à custa da adição e igual ou superio e de novo à secura. 2º Pass olada sobre placa de aquecimento com agitação magnética. Adicionaram-se, ordenadamente, 40 o de periodato de sódio 0,06 M e 20 mL de uma solução de permanganato de potássio 0,03 M. Elevou-se a
tem manteve-se durante 6 h. Durante es odo de reacção foi
necessário repor a concentração de permanganato no meio reaccional, pelo que se juntaram
po dio e de 0,095 g de permang de potássio, sempre
qu a coloração roxa. A reacção foi interrom ela adição de 10 mL
de de 10 minutos para precipitação do dióxido de
manga A suspensão foi filtrada em cadinho filtrante nº 4 e lavada com cerca de 10 mL de uma so
3º Pass
aquosa de ácido dietilenotriaminopentacético (DTPA) a 0,3% com pH=7,20 mL de uma ligeira e pela agitação suave da mistura do balão. Através da ampola de decantação adicionaram-se, gota a gota, ao meio reaccional 2 mL de dimetilsulfato. A reacção prosseguiu com consumo de base, te
de uma solução de KOH 1M.
A reacção terminou quando cessou o consumo de base e o pH se mantev
r a 11. Após esta reacção a mistura foi acidificada com uma solução de H3PO4 0,5 M até pH=3. Seguiu-se um período de 30 minutos de repouso e depois uma neutralização com uma solução de KOH 1 M, até pH=6,5. Transferiu-se toda a mistura para um balão de fundo redondo de 500 mL e evaporou-se à secura em rotavapor, a 40ºC. Adicionaram-se 20 mL de uma solução de t-butanol/água 3:1 (v/v), agitou-se a mistura e evaporou-s
o – Oxidação com permanganato de potássio
O resíduo metilado obtido na primeira etapa foi suspenso em 40 mL da solução de t- butanol/água 3:1 e o balão foi colocado num banho de água com temperatura contr mL de uma solução de hidróxido de sódio 0,5 M, 100 mL de uma soluçã
peratura para 82ºC e te perí
rções de 1,28 g de periodato de só anato
e na mistura se esbateu pida p
etanol. Seguiu-se um período de repouso nês.
lução de hidrogenocarbonato de sódio a 1%. O filtrado líquido foi extraído com 2 x 50 mL de éter dietílico. As fases etéreas foram extraídas com 15 mL da solução de hidrogenocarbonato de sódio. Todos os extractos aquosos foram reunidos em balão de fundo redondo e neutralizados com uma solução de ácido sulfúrico 9 M até pH=6,5. Esta solução foi concentrada até pequeno volume (≈ 30 mL) em evaporador rotativo, a 40ºC.
o – Oxidação com peróxido de hidrogénio
solução de t-butanol/água 1:1 e 0,9 g de carbonato de sódio anidro. O balão, ao qual se ontrolada sobre placa d to com agitação magnética. A oxidação foi desencadeada pela adição de 5 mL de peróxido d drogéni
durante 10 minutos, após o que se interrompeu a reacção por adição de 100 mg de óxido de manganês. Seguiu-se um repouso de 2 h à temperatura ambiente para decomposição do peróxido de hidrogénio remanescente. Decorrido este tempo a suspensão foi filtrada em cadinho filtrante n e o precipitado foi lavado com pequeno volume de água destilada. O
filtrado aquoso foi acidificado com a solução de áci até pH=2 e
posteriormente extra mL de uma solução de acetona/diclorometano 1:1
(v/v). As fases orgânicas foram reunidas e secas com sulfato de sódio anidro. Finalmente
fo rador rotativo, a 40ºC.
4º Pass
ar o diazometano preparou-se uma montagem de destilação simples e um balão de fundo redondo de 2 tubuladuras colocaram-se 4,8 g de KOH, 9 mL de água 8 mL de éter dietílico. Sobre esta mistura fez-se gotejar uma solução
o, havendo persistência da cor amarela. O resíduo sólido resultante foi purificado dissolvido num pequeno volume de acetona.
juntou uma barra magnética, foi colocado em banho de água com temperatura c e aquecimen
e hi o a 30%. A mistura foi aquecida e mantida a 50ºC
º 4
do sulfúrico 9 M ído com 3 x 100
ram evaporadas até à secura em evapo o – Esterificação
A esterificação dos ácidos orgânicos obtidos na etapa precedente foi efectuada lentamente através da adição, gota a gota, de uma solução de diazometano recentemente preparada.
Para prepar n
destilada, 28 mL de metanol e
de 17,2g de N-nitroso-N-metil-p-toluenosulfonamida (Diazald) em 100 mL de éter dietílico, colocada numa ampola acoplada à segunda tubuladura do balão. O sistema foi mantido com agitação magnética suave em banho de água a 60-65ºC. O diazometano libertado foi recolhido em erlenmeyer contendo éter dietílico, mantendo-se este recipiente em banho de água e gelo. O diazometano foi guardado em frasco de cor âmbar, hermeticamente vedado, a uma temperatura de -10ºC.
A reacção de esterificação dos ácidos resultantes da oxidação dos fragmentos da lenhina deu-se por concluída quando se deixou de notar qualquer reacção com a adição de diazometan
Análise
ratório por esterificação do ácido piromelítico comercial com diazom
os ésteres utilizou-se um romatógrafo gasoso Fison GC-8000 series, com um detector de massas MS Trio 1000. Usou-
sílica fundida DB-5 da J&W Scientific, com um comprimento de 30 m, um diâmetro interno de 0,25 mm e uma espessura de filme
de 25 µm. As condições usad II.X.
Tabela II.X – Condições do G
Parâmetro Valor
por GC-MS
Na quantificação dos ésteres metílicos obtidos utilizou-se como padrão interno o éster tetrametílico do ácido 1,2,4,5-benzenotetracarboxílico (ou ácido piromelítico). Este éster foi sintetizado no labo
etano, controlada por análises em GC-MS. O padrão interno foi dissolvido em acetona e a solução de concentração conhecida foi guardada a 4ºC, em frasco perfeitamente vedado.
Adicionou-se a cada uma das amostras dos ésteres a analisar 10 mg de padrão interno. Na separação cromatográfica e quantificação d
c
se hélio como gás de arraste e uma coluna capilar de
as na separação constam da tabela C-MS para a quantificação dos ésteres.
Temperatura do injector 250ºC
Temperatura inicial do forno 150ºC
Rampa de subida de temperatura 5ºC/min
Temperatura final e do detector 270ºC
Tempo à temperatura final 7 min
Potencial de ionização da fonte 70 eV
Foram executadas as curvas de calibração do fragmento correspondente ao grupo guaiacilo e o factor de resposta foi aproximadamente unitário, tal como reportado por Gellerstedt (1992), tendo sida assumida a mesma correlação entre as massas e as áreas medidas por GC.