3.2.1 Micro-organismo
A levedura Saccharomyces cerevisiae (CCA008) utilizada nos ensaios fermentativos foi obtida a partir do banco de culturas do Laboratório de Microbiologia Agrícola e Molecular –
LACAM –UFSCar, sendo esta uma levedura floculante portadora do gene FLO5α.
3.2.2 Obtenção do suco de caju
O suco de caju utilizado como meio de cultura para o crescimento celular e produção de etanol foi obtido a partir da prensagem do pedúnculo de caju (Anarcardium occidentale L.), apresentando concentração inicial de açúcares redutores (glicose + frutose) entre 100 e 120 g.L-1.
Após a extração, o suco foi centrifugado a 6000 rpm por 10 minutos e o seu pH foi ajustado para 4,5 utilizando H2SO4 na concentração de 1 M. A esterilização se deu em autoclave a 110 °C por
10 minutos.
3.2.3 Meio de cultura para manutenção e propagação do micro-organismo
Para a manutenção da levedura, utilizou-se o meio complexo YEPD (Yeast Extract- Peptone-Dextrose) constituído por: Extrato de levedura 10 g.L-1, Peptona 20 g.L-1, Glicose 20
g.L-1 e Ágar Sabouraud 20 g.L-1. O pH do meio foi ajustado para 4,5 utilizando H
2SO4 P.A. e a
esterilização se deu em autoclave (Phoenix, Araraquara, SP, Brasil) a 110 °C por 10 minutos. A cultura foi mantida em ambiente refrigerado a 4°C em tubos. Para a propagação e obtenção da concentração de inóculo desejada, preparou-se meio complexo YEPD (Yeast Extract-Peptone- Dextrose) constituído por: Extrato de levedura 10 g.L-1, Peptona 20 g.L-1 e Glicose 20 g.L-1. O
mesmo foi esterilizado em autoclave a 110 °C por 10 minutos.
3.2.4 Avaliação da temperatura na fermentação alcoólica do suco de caju
A fim de determinar como a temperatura influencia a produção de etanol, estudou-se a cinética fermentativa do processo de conversão dos açúcares presentes no suco de caju em etanol, utilizando a levedura floculante Saccharomyces cerevisiae (CCA008). Os ensaios fermentativos ocorreram nas temperaturas de 26, 30, 34, 38 e 42 °C. O processo fermentativo foi
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conduzido em biorreator batelada de 1 L (Tec-Bio, Modelo 1,5, Tecnal, SP, Brasil), utilizando 750 mL de suco de caju, sendo o mesmo ilustrado na Figura 3.1.
Figura 3.1 – Representação esquemática do Biorreator Tec-Bio 1,5 utilizado neste trabalho
Fonte: Autoria própria.
Este biorreator consiste em um vaso de aproximadamente um litro de volume útil, com sistema de aquisição de dados que possibilita controlar algumas variáveis do processo como temperatura, pH, agitação, aeração e vazão de nutrientes. A fermentação ocorreu com agitação de 150 rpm e sem aeração. A concentração inicial de substrato utilizada (glicose + frutose) foi de aproximadamente 100 g.L-1, valor esse próximo à concentração inicial de açucares presente no
suco de caju in natura e dentro da faixa ótima determinada por Pinheiro (2011). A concentração inicial de células utilizada foi de 5 g.L-1. Acompanhou-se a cinética fermentativa durante 10
horas, na qual amostras foram retiradas em intervalos de 2 horas para posterior análise. 3.2.5 Influência da concentração celular inicial
De posse do valor de temperatura que apresentou o melhor rendimento para a fermentação, avaliou-se a influência da concentração inicial de inóculo no processo fermentativo. Foram avaliadas as concentrações iniciais de células de 3, 5, 8 e 10 g.L-1. Os
experimentos foram conduzidos em condições similares às descritas no Tópico 3.2.4, sendo a temperatura utilizada a que proporcionou o melhor rendimento ao processo avaliado no Tópico 3.2.4. A agitação e a concentração inicial de substrato não foram alteradas.
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3.2.6 Efeito da intensidade de agitação
Os ensaios foram conduzidos com velocidade de agitação de 80, 150, 300, 490, 650 e 800 rpm. Novamente, os experimentos foram conduzidos em condições similares às descritas no Tópico 3.2.4, sendo a temperatura utilizada a que proporcionou o melhor rendimento ao processo avaliado no Tópico 3.2.4 e a concentração de inóculo a que apresentou melhor rendimento ao processo avaliado no Tópico 3.2.5, mantendo-se inalterada apenas a concentração inicial de substrato.
3.2.7 Métodos analíticos 3.2.7.1 Concentração celular
A concentração de biomassa foi realizada pela determinação da densidade óptica (D.O) a 660 nm, em espectrofotômetro Spectronic® 20 Genesys. O método baseia-se na medida da turvação do meio em função da quantidade de células em suspensão, possuindo vantagens como rápida execução e utilização de equipamentos relativamente simples.
3.2.7.2 Concentração de substrato e produto
As concentrações de açúcares (glicose e frutose) e etanol foram quantificadas através de análise de cromatografia líquido de alta eficiência - CLAE, equipado com um detector de índice de refração Waters 2414 (Waters, Milford, MA, EUA) e com uma coluna Aminex HPX- 87H (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). Ácido Sulfúrico, H2SO4 5 mmol.L-1 foi usado como fase
móvel na vazão de 0,5 mL.min-1 a 65 °C. O volume de injeção das amostras foi de 20 µL.
3.2.7.3 Cálculo dos Rendimentos e parâmetros cinéticos
Os dados obtidos experimentalmente (concentração de biomassa, substrato e produto) foram utilizados na determinação dos parâmetros cinéticos da fermentação. A produtividade volumétrica de etanol (Qp, g.L-1.h-1) foi calculada como a razão da concentração
máxima de etanol obtida (Pmáx, g.L-1) e o tempo de fermentação no qual Pmáx foi alcançado (t, h),
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= á� . A conversão do açúcar consumido em etanol formado (YP/S, g.g-1) foi definida de
acordo com a Equação 3.2.
⁄ = − .
A conversão de substrato consumido em biomassa (YX/S, g.g-1), foi definida de acordo
com a Equação 3.3.
⁄ = − .
Já a relação entre a quantidade de produto formado e a concentração celular, pode ser calculada pela Equação 3.4.
⁄ = .
A eficiência da conversão de açúcar em etanol (η, %) foi calculada pela Equação 3.5.
� = ⁄ × . sendo Yt o valor teórico de YP/S (0,511 g.g-1) definido a partir da equação de Gay-lussac.
Já a máxima velocidade específica de crescimento (µmáx), pode ser calculada a partir
do balanço para a célula na fase de crescimento exponencial, como pode ser observado na Equação 3.6.
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