MATERIALES Y MÉTODOS
PROGRAMA SIGMAPLOT
El programa Sigmaplot v. 10,0 [SIGMAPLOT, 2005] fue utilizado para realizar representaciones gráficas y para el tratamiento de algunos de los datos experimentales obtenidos en este trabajo. El programa Sigmaplot utiliza el algoritmo de Marquardt-Levenberg [MARQUARDT, 1963] para encontrar los parámetros que aporten el mejor ajuste entre la ecuación teórica y los datos experimentales. El programa posee alrededor de cien ecuaciones de ajuste, a la vez que posibilita la edición de nuevas ecuaciones. En ambos casos, se deben especificar los parámetros iniciales (hasta un máximo de 25 y de 10 variables independientes de la ecuación) y fijar el intervalo del valor de estos parámetros. El ajuste se realiza optimizando el valor de los parámetros que minimiza el valor de la suma del cuadrado de la diferencia entre el valor observado y el predicho para las variables dependientes. Este proceso es iterativo y se repite hasta que el error relativo es inferior al valor de tolerancia establecido, es decir, hasta que se consigue la convergencia. En este sentido, el programa permite cambiar los valores de tolerancia y el número de iteraciones preestablecidos. Finalmente, el programa proporciona una representación de los valores obtenidos que se ajustan a la ecuación, así como un informe con el valor de los parámetros y un análisis estadístico completo.
El análisis estadístico de los datos realizado por el SigmaPlot incluye el coeficiente de correlación de los datos experimentales a la ecuación teórica con su correspondiente error estándar. De cada parámetro se da el error estándar, la distribución t de Student y el factor de
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inflación de la varianza. Se detalla también un análisis completo de la varianza (ANOVA) y se incluyen los tests estadísticos de PRESS (residual predicho de la suma de cuadrados), Durbin-Watson (autocorrelación de los residuales) y test de normalidad.
A continuación se indican los estudios realizados con este programa, especificando en cada caso la ecuación utilizada para el ajuste de los datos experimentales.
Determinación de las constantes de ionización de la 4-aminometilpiridina y la PM por valoración de 1H-RMN
Los desplazamientos químicos de un compuesto con propiedades ácido/base dependen del pH de la disolución, de tal manera que el pKa se puede determinar utilizando señales de 1 H-RMN o de cualquier otro núcleo H-RMN activo (13C, 15N, 31P, 19F,…). Por tanto, la determinación de las constantes de ionización en D2O para la PM y la 4-aminometilpiridina (PAM) se realizaron examinando la variación en el desplazamiento químico de las señales de protón en el rango de pD de 6,0 – 13,0, lo que permite determinar la constante de ionización del grupo amino para ambos compuestos y del N piridínico de la PM.
La disociación de un protón en un compuesto ácido HA (ecuación 2.4) cambia la densidad electrónica de la molécula, por lo que las especies HA y A- presentan diferentes desplazamientos químicos denominados como δHA y −
δA . La mayoría de ácidos en disolución acuosa se caracterizan por una rápida transferencia de protones en la escala temporal de RMN.
Así, el desplazamiento químico observado (δobs) para cualquier núcleo adyacente representa la concentración media ponderada de los desplazamientos químicos de cada especie en el
Siendo [HA]T la concentración total del compuesto, que se define como la suma de las concentraciones de las especies HA y A-. Este balance de materia y la ecuación que define la constante de equilibrio de la reacción 2.4 se sustituyen en la ecuación 2.5 obteniendo finalmente la siguiente ecuación:
La representación de δobs vs pD y el posterior tratamiento de esta ecuación no lineal proporciona el valor de tres constantes (Ka, δHA y −
δA ), aunque los valores preliminares de δHA y −
δA pueden ser supuestos directamente de los datos experimentales. El valor de las constantes obtenidas se especifica en el artículo IV.
Determinación de las constantes de equilibrio de formación de la carbinolamina entre el FA y las especies iónicas de la PM y la PAM
A partir de las constantes de ionización de la PM en D2O se puede estimar una constante de equilibrio de formación de la CA para cada especie iónica. Teniendo en cuenta que los valores obtenidos experimentalmente están en el intervalo de pD 6–13, no se considera la especie H3PM2+
ni el valor de K1. Los equilibrios de disociación de las restantes especies iónicas son:
]
El balance de materia en este intervalo de pD es:
]
Por lo que se puede deducir:
3
Donde KCAA es la constante de equilibrio de formación del compuesto CA entre la especie iónica H2PM+ y el FA, KCAB es la constante de formación entre la especie HPM y FA, y KCAC es la constante de formación entre la especie PM- y FA. El valor de las constantes obtenidas se especifica en el artículo IV.
Determinación de las constantes de velocidad correspondientes a reacciones de pseudo-primer orden
Se estudiaron algunas reacciones de segundo orden en condiciones de pseudo-primer orden. En presencia de un gran exceso de B con respecto a A, la concentración de B no cambiará significativamente durante la reacción, por lo que la ecuación diferencial de este
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proceso se escribe según la ecuación 2.11. De este modo, la constante de velocidad k’ incluye la concentración de B y la verdadera constante de velocidad (k) (ecuación 2.12). La integración de la ecuación 2.11 y su posterior linealización resulta en la ecuación 2.13, a la cual se ajustan los datos experimentales (concentración, área, absorbancia,…) obtenidos en los artículos I y II.
[ ]
k' A[ ]
dt A
d =− (2.11)
[ ]
Bk
k'= (2.12)
[ ] [ ]
A ln A k'tln = 0− (2.13)
Determinación de las constantes de ionización mediante valoración potenciométrica
La determinación de las constantes de ionización de los compuestos PEA, PSer, APP, DHPE y DHPS se realizó por valoración potenciométrica utilizando un pH-Stat según se detalla en el apartado 2.2.4 de este trabajo. El número de grupos ionizables de cada compuesto define el número de constantes de ionización a determinar. La ecuación de ajuste de los datos experimentales se obtiene considerando las ecuaciones del balance de materia y de la condición de electroneutralidad para cada sistema.
A continuación se detallan los equilibrios de ionización estudiados para cada compuesto y la ecuación de ajuste que se utilizó para determinar las constantes de ionización de cada compuesto. Para todas las ecuaciones Kw es el producto iónico del agua a la temperatura a la cual se realiza la valoración, Ki son las constantes de ionización, C0 es la concentración inicial del compuesto a valorar, V0 es el volumen inicial de la disolución a valorar, CCl− es la concentración de HCl y CNa+ es la concentración de NaOH.
Valoración del PEA. El esquema 2.2 muestra los equilibrios de ionización del PEA. Los datos experimentales de variación del volumen en función del pH se ajustaron a la ecuación 2.14. El valor de las constantes obtenidas se especifica en los artículos I y III.
NH3 O
P O HO
O
NH3 O
P O O
O
NH2 O
P O O
O K3
K2
Esquema 2.2. Equilibrios iónicos correspondientes al PEA.
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+ +
Valoración de la PSer. El esquema 2.3 muestra los tres equilibrios de ionización de la PSer que se observaron en su valoración. El ajuste de los datos experimentales se realizó a la ecuación 2.15. El valor de las constantes obtenidas se especifica en los artículos I y III.
NH3
Esquema 2.3. Equilibrios iónicos correspondientes a la PSer.
+ + del pH se ajustaron a la ecuación 2.16. El valor de las constantes obtenidas se especifica en el artículo I.
Esquema 2.4. Equilibrios iónicos correspondientes al APP.
+ +
Valoración de la DHPE. El esquema 2.5 muestra el equilibrio de ionización de la DHPE que se observó en su valoración. Para obtener una buena curva de valoración se añadió a la disolución a valorar HCl. La concentración inicial de éste compuesto (CCl
- = 5·10-4 M) se
Esquema 2.5. Equilibrios iónicos correspondientes a la DHPE.
] por lo que al hacer el balance de cargas debe tenerse en cuenta la concentración de esta sal.
De esta manera se obtiene la ecuación 2.18 para ajustar los datos experimentales. El valor de las constantes obtenidas se especifica en el artículo II.
O
Esquema 2.6. Equilibrios iónicos correspondientes a la DHPS.
+ +
Determinación de los coeficientes de absorción molar de las BSs derivadas del PLP Los coeficientes de absorción molar de las BSs formadas entre el PLP y la DHPE y la DHPS se determinaron a 420 nm a partir de la ecuación 2.19 propuesta por Auld y Bruice [AULD, 1967]. Para la realización del ajuste se consideró que a 420 nm el coeficiente de absorción molar de los nucleófilos es despreciable y el del PLP vale εPLP = 2850 M-1 cm-1. valores de εBS se obtuvieron mediante un proceso iterativo en el que se comenzó introduciendo los valores de concentración de amina inicial en la ecuación (2.19), lo que proporciona un primer valor de εBS y de Keq. El valor de Keq obtenido se utiliza para calcular la concentración de amina en el equilibrio, y así sucesivamente, hasta que los valores de εBS obtenidos diferían menos del 0,1 %. Los valores obtenidos se especifican en el artículo II.
Determinación de las constantes cinéticas para la reacción con el PLP
La ecuación 2.20 corresponde a la reacción de los grupos amino con el PLP. El tratamiento matemático para obtener las constantes cinéticas fue descrito anteriormente en detalle [GARCÍA DEL VADO, 1987]. Brevemente, a partir de la integración de las ecuaciones cinéticas para dicho mecanismo y aplicando la ley de Lambert-Beer, en una longitud de onda en la que el aminofosfato no absorba, se obtiene la ecuación 2.21. En esta ecuación A0, A y A∞ son las absorbancias a tiempo 0, t y en el equilibrio; los parámetros a y b son las concentraciones iniciales de PLP y compuesto amínico, respectivamente; x y xe son las concentraciones de la BS a tiempo t y en el equilibrio, respectivamente. Los valores de kap se obtienen de la pendiente de la representación de ln (A∞-At) vs tiempo, siempre que ab >> xxe (figura 2.4). Manteniendo constante la concentración de PLP y variando la concentración de grupo amino en un amplio rango se obtienen diversos valores de kap que se ajustan a la ecuación 2.22 (figura 2.5), donde kf
y kh son las constantes cinéticas para la formación y la hidrólisis, respectivamente, de la BS.
Esta metodología se ha utilizado en los artículos I y III.
R CHO (PLP) + R' NH2 kf
( )
[ ]
{
h f 2 4 2f}
ap k k a b abk
k = + + − (2.22)
t (s)
0 10 20 30 40 50 60 70 80
-3,5 -3,0 -2,5 -2,0 -1,5 -1,0
a
b
c e d f ln ( Ainf - A)
Figura 2.4. Ejemplo de la representación del ln (A∞-A) frente al tiempo a 420 nm correspondiente a la mezcla de reacción entre el PLP (0,16 mM) y diversas concentraciones de PEA a pH 9,0 y 25°C. Concentraciones de PEA: a) 7 mM, b) 10,6 mM, c) 14 mM, d) 17,7 mM, e) 20 mM, f) 25 mM.
[PEA] (M)
0,006 0,008 0,010 0,012 0,014 0,016 0,018 0,020 0,022 0,024 0,026 k2 ap (min-2 )
0 1 2 3 4 5 6
a
b
c
d
e
f
Figura 2.5. Variación de la kap2 correspondiente a la mezcla de reacción entre el PLP (0,16 mM) y diversas concentraciones de PEA a pH 9,0 y 25°C. Los valores experimentales se representan como puntos, mientras que en trazo continuo se representa el mejor ajuste de los datos experimentales a la ecuación 2.21. Concentraciones de PEA a) 7 mM, b) 10,6 mM, c) 14 mM, d) 17,7 mM, e) 20 mM, f) 25 mM.
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[FA] (M)
0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14
Concentration (M)
0,000 0,001 0,002 0,003 0,004
Capítulo 3.
RESULTADOS
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80