Probe tested on capillary gel electrophoresis

Em XAC são encontrados 31 genes com domínio GGDEF, 14 codificam EAL e 3 domínios HD-GYP (Figura 15). Na maioria dos casos, estes domínios apresentam-se fusionados a outros domínios envolvidos na sinalização celular em bactérias (PAC, PAS, GAF e RR). No genoma de XCC foram identificados 21 genes que codificam proteínas com somente um domínio GGDEF, 5 com um domínio EAL, mais 8 com ambos os domínios GGDEF e EAL, e 3 com somente o domínio HD-GYP (Galperin, 2006).

Nosso grupo demonstrou que o domínio HD-GYP de RpfG interage com o domínio GGDEF de um grupo de proteínas de XAC (Andrade et al., 2006). A posteriori, esta interação entre os domínios RpfGHD-GYP e proteínas GGDEF também foi verificada em XCC (Ryan and

Dow, 2011)

Especialmente demonstramos que o domínio RpfGHD-GYP de XAC interage com nove

proteínas contendo domínios GGDEF (XAC0258, XAC0424, XAC0593, XAC0644, XAC1420, XAC1486, XAC1939, XAC1940 e XAC2382). A maioria destas proteínas, além de apresentar o domínio GGDEF, também possui outros domínios associados, como por exemplo, domínio sensor para captar sinais intra ou extracelular e regular a atividade de diguanilato ciclase (Andrade et al., 2006; Ryan et al., 2010a) (Figura 15).

Figura 15. Arquiteturas das proteínas GGDEF, EAL e HD-GYP codificadas pelo genoma de XAC adaptado de (Andrade et al., 2006). As proteínas foram agrupadas de acordo com as similaridades dos seus domínios. O número do gene no genoma de XAC que codifica a proteína está mostrado no lado direito (Da Silva et al., 2002). Destacado em roxo estão os números dos genes que codificam as proteínas com domínio GGDEF que interagiram com o domínio HD-GYP de RpfG no ensaio de dois híbridos. As seguintes proteínas com domínio GGDEF são preditas terem hélices transmembranas pelo programa PSort (Nakai and Horton, 1999): XAC3460, 1570, 1939, 1940, 1486, 0593, 0644, 2382, 2711, 1938, 2812, 1993, 2897, 1345 and 1488. Todos os domínios estão caracterizados de acordo com o programa Pfam database (http://pfam.wustl.edu/).

A Figura 16 mostra a frequência relativa de conservação dos aminoácidos em proteínas GGDEF em bactérias. Análise comparativa das estruturas primárias dos domínios GGDEF presentes no genoma de XAC revela que algumas diguanilato ciclases possuem o sítio ativo (sítio-A) degenerado, portanto podendo não apresentar atividade enzimática (Fig. 16). No entanto, algumas destas proteínas GGDEF podem ter mantido a capacidade de apenas se ligar a e c-diGMP através do seu motivo RxxD denominado sítio alostérico (sítio-I). O complexo GGDEF-cdiGMP pode ter se especializado em regular um determinado processo celular através da interação proteína-proteína, como no caso da proteína PopA (Parálogo de PleD) em C. crescentus. O complexo PopA-cdiGMP é direcionado para um dos pólos celulares e ativa a proteólise do inibidor de replicação o que permite a progressão do ciclo celular (Duerig et al., 2009). Na figura 17 podemos constatar que a metade das GGDEF codificadas por XAC apresentam o sítio-I (RxxD) conservado e por outro lado um terço delas mostram os resíduos G/G/D-E/E/F do sítio-A degenerados. As diguanilato ciclases que interagem com o domínio RpfGHD-GYP possuem o sítio ativo (sítio-A) conservado, sugerindo

que todas têm a capacidade de sintetizar c-diGMP.

Figura 16. Frequência relativa de conservação dos aminoácidos nos domínios GGDEF de bactérias (adaptado de Galperin et al., 2001).

Figura 17. Análise comparativa dos resíduos presentes nos domínios GGDEF de XAC. A caixa verde destaca os resíduos RxxD do sítio alostérico (sítio-I), e caixa preta os resíduos que formam o sítio ativo (sítio-A) das enzimas diguanilato ciclases de XAC. As proteínas que possuem o sítio-I conservado são: XAC593, XAC0614, XAC2482, XAC1939, XAC1940, XAC1420, XAC1570, XAC0644, XAC4358, XAC0424, XAC1345, XAC1488, XAC2897 e as GGDEF XAC2812 e XAC1993 com RxxD deslocado no alinhamento. O grupo de proteínas GGDEF que têm o sítio-A conservado, portanto podem sintetizar c-diGMP, são: XAC0258, XAC1486, XAC0614, XAC2482, XAC3460, XAC1939, XAC1940, XAC1420, XAC1570, XAC0644, XAC4358, XAC0424, XAC1345, XAC1488, XAC2897, XAC2810, XAC2812, XAC2382.

Xac0258 TEELSRTDELTGLHNRRGLA--LHLQEC--RRAGHVPGVGLILIDCDRFKRINDEFGHLA 56 Xac1486 LEELASLDALTGLPNRRMLERALTHQID--QRQPHDRLNSLIILDLDHFKEVNDLYGHAA 58 Xac0593 LSRLAMRDELTGLPNRRAIRTEAQQQIE--QALRSHTPGMLALIDLDHFKQINDVYGHAT 58 Xac0614 LLDDAQRNALTGLRNRKTFDDVILRLFAGGADSAAEQGVWLGIVDIDHFKRVNDTFGHLY 60 XAC2482 LQDLATRDFLTGLPNRRYFLEQSQRVIP--KLLLEDQTVTAAMVDIDHFKHINDTWGHEA 58 XAC3460 LEYRASHDVLTALPNRREAERVLQQWFD--EAHAGGAALALALMDIDHFKRINDDYGHEV 58 Xac1939 LALKASHDALTGLLNRSGILEAMAEELQGCAHGE--HPLAVVLIDLDHFKQVNDEHGHLV 58 Xac1940 LSLKATHDELTGLLNRAGILAALREMLLHAEHQG--RPLAVVLIDLDHFKLVNDQHGHLA 58 Xac1420 LAEQASRDALTGVFNRHQLGTALTHEFELASRQG--WPLSIAFIDLDDFKRVNDAHGHLV 58 Xac1570 FERQAHEDALTGLPNRRHFDEALARDISRARRSA--RPLVLAILDIDHFKRINDHYSHAS 58 Xac0644 LKKHALFDPLTEALNRRGCEQAMRDSVIASQREG--WPFVLFVLDMDNLKQINDRFGHLA 58 Xac4358 -LEWSFTDPLTNCYNRRFLDELDKRDPAVR---WGCIVVDLDKFKLVNDTHGHQR 51 Xac0424 VAGLVREDQLTGALNRRGFEELFQREAVRTQRSG--QPLCVAMLDLDDFRRLNETHGHAG 58 Xac1345 LRRQSIRDALTGLYNRRYLEESLSHELARCARRG--LPLPVLMLDVDHFKQFNDSQGHAG 58 Xac1488 LRQQSIRDPLTGLYNRRYLEETLSHELARCTRRE--LPLSVLMLDVDHFKRFNDLHGHSG 58 Xac2897 LSTEAWVDALTGIANRRAFDHRLSRALQDAVRLE--APLSVLMIDVDHFKLYNDTYGHVN 58 Xac2810 LVEQTRTDPLTGLPNRRAFAVALAAA TEQTRAVG--QPLSVALLDVDHFKTVNDVHGHDQ 58 Xac2446 VELDALRDALTGRWNRAGLEHALHALADAPSS-AADAPLGFMLLELDGFKRQKLQAGAPA 59 Xac2812 VAFHARHDAMTGLINRHEIERRLLRLIELPQ--SPQMCHALCFVDLDHFKLVNDTFGHAV 58 Xac0610 MHERATRDALTGLPNRHAWSEALQVAVAQAQQQQ--RSVAVMFLDLDGFKRINDVYGHRA 58 XAC2711 ILHQARHDALTGLPNRIWLLERLKDVVDQTVASG--GTAAVLILDLERFKELNDSLGHDF 58 Xac2382 VRHMAYTDALTGLTNRLGFREGLDHLLHTARSTD--SKLALLFADIDDFKRVNDTLGHEA 58 Xac1938 LALATLHDPLTRLPNRILLHEHLVQNIERAQRQG--QRFAVMLINLDGFKVINDGYGHAL 58 Xac1993 IELLAHYDRLTGLPNRFLLREQAENAIREANERG--QTLAMLLIDLDGFKSINDSFGHAT 58 Xac1887 VHQLAFYDTLTGLPNRIMFSARAEQALTQAEYAG--EPAALMFINIDRFKLINDSQGHAA 58 Xac1992 --- IVKPTRLGAGSPELLHLVDAAASGG--PPLMIFHVDIDHFASINENMSGEV 49 Xac2398 ---LRQRDQVTGLLNRPTFMVALEQAVAQAGRSE--GQSGFLLIEPDHYARILPEFGLDS 55 Xac1795 LRSTTYRDGPTGLPNRSRFSEDLDTWLSQRDTAPATTAVAIDVCGSDYFRDMVKALGWEY 60 Xac0495 --VSVRSNPETGLPTRGHVMDLLADALERKQSGG---LFFIEIASALGLRERYGYAA 52 Xac0258 GDRVLQNVA----HALRSVIAEGDLACRLGGDEFCVLVAQGTSELVHHIGECIVR-AVEA 111 Xac1486 GDAALSDLA----TILRFEVREPHQVFRFGGEEFVVLLRAGSLAELEAATERLRK-VIRN 113 Xac0593 GDTVLKALA----SASRLALRGQDRLGRLGGEEFLLVLPGCGEEEIPTVFTRLRS-AVAA 113 Xac0614 GDEVLLLVA----QLMQRAFRQDDLLFRFGGEEFVIVLRGVDRDTAVSLFERFRLAVAEH 116 XAC2482 GDQALRAVA----ASVSGHARPQDLVARFGGEEFCLLVPGLDAANATSYFETLRERISA- 113 XAC3460 GDAVLSAIG----EVLSEQDQAHCFAARHGGEEFLLAATGLDAVQARALFERMRQRLAD- 113 Xac1939 GDAVLAKVG----ARLTACLRDSDKVGRYGGEELLLLLPGMSQQSQ-HRLRAIHEALSLA 113 Xac1940 GDAVLAGVG----RRMDTLMRGDDRIGRYGGEELLALLPGLNLDAT-HRLDALHRGICGD 113 Xac1420 GDEVLRNFA----QTLQRMVRTSDLVARYGGEEFLVILPNTPADAALMVIERILAETART 114 Xac1570 GDAVLHEVG----VLLTAAARASDLPARLGGEEFALLLADTTLDEA-QALCLRIRALFHA 113 Xac0644 GDRVLVRLV----DSAYGWLGAQDWVGRWGGDEFLIGIHAS----EDDATLKLNQWLSML 110 Xac4358 GDEVLVQMA----WFLNQPLRTQDRLVRLGGDEFLVLLHQA----SQTQLDALKRDY--- 100 Xac0424 GDAALRHTV----EVAKAVLRTTDAIARFGGEEFVLLLPDSTIFEASAAVIRLQRALSQR 114 Xac1345 GDLLLAAVG----ELLLTRLRAEDVACRYGGEEFTVLLPEADGEEAMRVAEQIRGYIAAL 114 Xac1488 GDRVLAAIG----ELLLAQTRGEDICCRYGGEELTIILPEVDLPTACMMAEKLRAGIEAL 114 Xac2897 GDACLRLIAG---AIAGCSRRSEDLAARYGGEEFGMILPHTDAAGALRLADAVRNAVAEL 115 Xac2810 GDAVLRELS----TLLRAHMAGAGTIARYGGEEFVLLLPNANLLQARVQCEYLRQSVAAM 114 Xac2446 ADATLLQVAT---LLEAQLPP-AAIVARLACDQFCVALPATAASAALAA AEDLRKAVEDA 115 Xac2812 GDRFLCHFAD---VITMQLRS-GDWLGRLGGDEFAILLANTDLAQAQIVLERMHGALGQP 114 Xac0610 GDAVLVAFG----SCLQRAAGERYLVARLAGDEFVVLLDGLQDAQAECAAVAERIRTLAA 114 XAC2711 ADQVLVEAGRRLVDVVQEPN----LVGRLGSDEFMVVVAQADAAS-VQQDAQRLLLQLRR 113 Xac2382 GDEALLQFASRISRAVAALGGDDAILARFGGDEFVILLQSGDVSLLAAQLADRLVHELSR 118 Xac1938 GDRLLVVVAERLNAHRRAHG----SLARLGADEF-VLVADIADPEDAAALAAHLVQALAV 113 Xac1993 GDNLLKLASARLHQHLRNSD----LFGRFSDDEFIVLLRDMSEPEDAGHVARKLIAALGE 114 Xac1887 GDGLLRDIALRVNDQVAATA----MLARLSGDEFALALPQCS-AEQASAAAERLLVSIAS 113 Xac1992 GDQALTLAAR----RLQEFLGARGKLWRHGSDEMVVVAVRRDDTPLPEDFAEEIRQQLEL 105 Xac2398 ADALIAALA----AHVASVLDDSVLAARFGEHSFALLLNGN-YARTHALAETVRNAFAQH 110 Xac1795 ADGYIAL AQR----RLAAYLPGGTLLYRLDPTTFGFLAQAEG--QRLATLCTKVSKAFTE 114 Xac0495 YERLMTQAG---HRLASAAQPYPLARLNDNSFLLLAVDMPEASLEQQALEIRQRLSAN 107

1.8. Os receptores para c-diGMP regulam diferentes processos na célula bacteriana