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Os resultados para a produção de aflatoxina pelo A. flavus nos grãos de amendoim, nas temperaturas de 25 e 30º C, são apresentados, nas Tabelas 12.9 e 12.10, respectivamente. Note-se que, para a menor umidade relativa (UR=± 75%), não houve produção de aflatoxina e que, para a umidade relativa intermediária (UR

= ± 84 %), os teores ficaram abaixo de 20 ppb, do regulamentado pela Resolução no 274, de 15 de novembro de 2002 (BRASIL, 2002). Já para a maior UR (UR=± 90 %), a produção de aflatoxina excede qualquer limite aceitável. Ainda que os outros resultados para UR de ± 84 % sejam aceitáveis, prevêem-se dificuldades para a Empresa A manejar os estoques e atender às legislações dos diferentes mercados consumidores, como os limites apresentados na Tabela 2.3, apresentada no Capítulo 2 deste trabalho.

Ao comparar os resultados obtidos na umidade relativa em torno de 90% verificou-se que os resultados em cromatografia em camada delgada são semelhantes aos obtidos no trabalho de resistência dos genótipos de amendoim realizado por Prado et al. (1999).

Tabela 12.9 - Isoterma de produção de Aflatoxina a 25oC.

* ND – Não detectado; limite de detecção de 1 a 300 ppb no fluorímetro. **ND – Não detectado; limite mínimo de detecção de 1 µg/g.

NA – Não Analisado

CCD – Cromatografia em Camada Delgada.

Sal Período P1– 15 dias Período P2 – 30 dias

Umidade Relativa Amostra (esporos/mL) Aflatoxina - Fluorímetro (ppb Aflatoxina CCD (µ/grama) Aflatoxina - Fluorímetro (ppb) Aflatoxina CCD ( µ/grama) U1 - NaCl (75,32 %) C2 (±106) ND* ND** ND* ND** ND* ND** ND* ND** U2- KCl (84,34 %) C2 (±106) ND* NA ND* NA ND* 6,9 1,322 12 U3 - BaCl2 (90,30 %) C2 (±106) 250 NA 260 NA 210 4182,62 220 5155,73

Tabela 12.10 - Isoterma de produção de Aflatoxina a 30oC.

* ND – Não detectado; limite de detecção de 1 a 300 ppb no fluorímetro. **ND – Não detectado; limite mínimo de detecção de 1 µg/g.

NA – Não Analisado

CCD – Cromatografia em Camada Delgada.

Estes resultados diferem dos de Prado et al. (1991), que verificaram a ocorrência de aflatoxina em umidades relativas de 93 e 97%, após 60 dias de incubação. Estes autores sugeriram que os grãos devessem ser desidratados até que a atividade de água do material fosse reduzida em níveis inferiores a 86%. No entanto, no presente trabalho os índices de aflatoxina não foram desprezíveis para UR de cerca de 84% em um período relativamente curto, de 15 dias. Ressalte-se que os experimentos de Prado et al. (1991) foram feitos com a carga natural de microrganismos, enquanto que os fungos A. flavus do trabalho atual foram inoculados após a esterilização das amostras, o que pode levar a uma maior produção de toxina num curto espaço de tempo devido à falta de microrganismos competidores.

Na Tabela 12.11 são apresentados os resultados dos testes de Tukey para as médias de teor de aflatoxinas determinadas por fluorimetria, tendo como variáveis a temperatura, a umidade relativa e o período de armazenamento.

Sal Período P1– 15 dias Período P2 – 30 dias

Umidade Relativa Amostra (esporos/mL) Aflatoxina - Fluorímetro (ppb) Aflatoxina CCD (µg/ grama) Aflatoxina - Fluorímetro (ppb) Aflatoxina CCD (µg/ grama) U1 - NaCl (75,09 %) C2 (±106) ND* ND** ND* ND** ND* ND** ND* ND** U2- KCl (83,62%) C2 (±106) 1,3 ND** ND* ND** 1,3 1,33 12 6,7 U3 - BaCl2 (89,90%) C2 (±106) 210 NA 220 NA 250 NA 250 6141,57

Observe-se que a variável temperatura não tem influência significativa sobre a produção de aflatoxina nos dois níveis testados, bem como os dois períodos de armazenamento. Apenas a variável umidade relativa, em seu maior valor, apresentou efeito significativo sobre as médias.

Tabela 12.11: Testes de Tukey para as médias de teor de aflatoxinas no amendoim em grão (fluorimetria).

Variável Temperatura Variável UR Variável Período

25 °C 78,4 A 74,87 % 0,0 B 15 dias 76,9 A 30 °C 79,7 A 82,95 % 3,49 B 30 dias 81,3 A

89,50 % 233,75 A

Estes resultados são compatíveis com os observados na literatura, uma vez que existe certa discordância em relação à faixa de temperatura ótima para a produção da micotoxina e mesmo quanto à umidade relativa. Diener e Davis (1966) observaram um alto índice de contaminação para temperaturas iguais a 25 e 30oC, enquanto que o ICMSF (1996) indica que os limites ótimos para a produção da toxina vão de 16 a 31oC. Deste modo, o fato de não haver diferença significativa entre os dois níveis de temperatura adotados é provável. Quanto à Umidade Relativa, o ICMSF (1996) indica uma faixa entre 82 e 99% com índices ótimo acima de 95%. Prado et al. (1991) não observaram produção de toxina para UR inferior a 86%, com atividade ótima ocorrendo para UR igual a 93%, de modo que o aumento da produção observado para a maior umidade relativa no presente estudo é coerente.

De acordo com o teste de Tukey para as médias do teor de aflatoxinas nos grãos de amendoim, mantendo-se constantes a umidade relativa e o período de armazenamento e variando-se apenas a temperatura, observou-se que não houve diferença significativa na produção da micotoxina nas temperaturas de 25 e 30 °C, provavelmente pelo fato de o gradiente térmico ser pequeno e estar contido dentro da faixa de temperatura ótima de desenvolvimento do Aspergillus. Também os testes de Tukey variando-se apenas o período de armazenamento, mantendo-se constantes a temperatura e a umidade relativa, mostraram não haver diferença significativa no teor de aflatoxinas presentes nos grãos de amendoim armazenados

pelos períodos de 15 e 30 dias, uma vez que o fungo inicia rapidamente as suas atividades metabólicas quando em contato com o substrato presente no amendoim, atingindo uma taxa metabólica estável após um curto período de tempo.

Por outro lado, de acordo com os testes de Tukey variando-se apenas a umidade relativa, mantendo-se constantes a temperatura e o período de armazenamento, foi observado um teor de aflatoxinas significativamente maior nos grãos de amendoim mantidos em ambiente com umidade relativa de quase 90 %, havendo menor ou nenhuma produção da micotoxina nos grãos mantidos em umidades relativas inferiores, o que se deve ao fato de o fungo exigir elevada atividade de água para o seu desenvolvimento e conseqüente produção da micotoxina como metabólito secundário.

Assim, pode-se afirmar que apenas a variável umidade relativa exerceu influência significativa na produção de aflatoxinas nos grãos de amendoim armazenados sob as condições estabelecidas na pesquisa. Observou-se também que a análise de fluorimetria teve o resultado atingindo o limite de leitura do fluorímetro para a umidade em torno de 90%. Assim, foram realizadas as análises em cromatografia em camada delgada para confirmação dos resultados onde se verificou que o resultado obtido por fluorimetria foi muito elevado.

Ao compararmos os resultados de cromatografia em camada delgada (CCD) com os apresentados por Prado et al. (1999), pode-se dizer que se um lote de amendoim, de qualquer variedade, se estiver com uma contaminação de fungo (esporos) na recepção, e não forem realizadas as medidas preventivas durante as etapas do processo, a contaminação por aflatoxina pode atingir índices de cerca de 1000 até 38000 ppb como foi apresentado pelos quatro genótipos de amendoim no estudo das resistências destes e também nos dados deste trabalho para a variedade Runner IAC 886.

CAPÍTULO 13