As imagens dos géis da condição Normal e da condição TiO2 (neutrófilos + TiO2, 30 minutos) foram analisadas com o auxílio do software Image Master 2D
Platinum versão 5.0 e versão 6.0 (GE Healthcare). A versão 5.0 do software têm
parâmetros com melhor resolução automática para smooth, que possibilita discriminar ruído de spot e definir spots em sobreposição; saliency, que define a curvatura de um spot, também ajudando a retirar ruídos e min area, que elimina artefatos próximos aos spots que não foi eliminado com a saliency e nem o smooth. Foram feitas as detecções automáticas, isto é, delimitações dos spots, segundo parâmetros descritos acima com valores preestabelecidos para cada gel, tais como, cobertura na delimitação de um maior número de spots, exclusão de background e melhor separação de spots próximos. Porém, os géis passaram por revisões de detecção feitas manualmente com ajuda dos recursos de visualização de spots em 3D, mudança de contrastes e/ou de cores e gráficos marcando a intensidade tanto na lateral quanto na parte superior, indicando onde um spot começa e termina. As revisões foram feitas para adicionar spots não detectados, separar e juntar spots e excluir background e artefatos da coloração detectados erroneamente.
Após essa criteriosa revisão as imagens foram transferidas para o software
Image Master 2D Platinum versão 6.0, onde foi processado o pareamento dos spots
entre os géis, com análises da variação da porcentagem do volume intra e intergrups.
Primeiramente selecionaram-se os Landmarks (pares de spots marcadores entre géis diferentes), e processou-se o pareamento automático. O pareamento também passou por revisões manuais criteriosas.
Os géis foram pareados da seguinte forma:
1- Quiescentes (controles): onde foi selecionado um gel quiescente HQ1 como referência, por ser o gel com maior número de spots e mais bem focalizado. Esse gel referência foi pareado com a duplicata de todos os géis normais,
2- Estimulados com TiO2: o gel TiO2 1A referência pareado com a duplicata de todos os géis TiO2,
3-Pareamento dos géis referências: Quiescentes e TiO2. (Figura 13).
Figura 13- Esquema geral do pareamento. Cada círculo representa um gel, divididos em duplicatas para cada indivíduo. Primeira etapa do pareamento (setas vinho) e a segunda etapa do pareamento (seta preta). Q (Quiescente) e TiO2 (dióxido de titânio). HQ1-Gel quiescente Master número 1 do indivíduo H, HT2- Gel titânio
Master número 2 do indivíduo H.
A seguir foi feita a revisão do pareamento com auxílio de ferramentas como: sobreposição das imagens dos géis pareados com diferentes cores; análise das vizinhanças dos spots; vetores que permitem visualizar a orientação dos pareamentos; scatter plot (gráfico de correlação dos spots entres os géis pareados). Foram obtidas tabelas com a normalização de cada spot pareado (porcentagens do volume), tanto intraclasse: classe quiescentes e classe TiO2, como interclasses:
TiO2 ET1 TiO2 HT1 TiO2 ET2 TiO2 RT1 TiO2 AT1 TiO2 NT1 TiO2 RT2 TiO2 AT2 TiO2 NT2 TiO2 HT2 Q HQ1 Q HQ2 Q EQ1 Q EQ2 Q RQ1 Q AQ1 Q NQ1 Q RQ2 Q AQ2 Q NQ2
classe quiescente e classe TiO2 comparados entre si. Esses dados foram submetidos à análise estatística. Para a determinação da quantidade relativa de cada spot foi usado o método de normalização do volume. Neste método o volume de cada spot foi dividido pelo volume total de todos os spots no gel e multiplicado por um fator constante de valor 100, que produz uma spots no gel e multiplicado por um fator constante de valor 100, que produz uma porcentagem de volume de cada
spot.
4.15.1 Análise Estatística
Os valores de porcentagem de volume dos spots nos 10 géis do grupo Quiescentes e nos 10 géis do grupo TiO2 foram utilizados para a análise estatística no programa SPSS® Base 13.0.
Para verificar se a distribuição dos dados poderia ser considerada gaussiana, levaram-se em conta os critérios de média das porcentagens de volume, mediana, simetria da curva de distribuição e proporção altura versus largura da curva além do teste de Kolmogorov-Smirnov.
O teste t pareado foi utilizado para as comparações de médias dos spots cujos valores apresentaram distribuição normal e o teste de Wilcoxon foi empregado para as comparações dos spots com valores de distribuição não paramétrica. O nível de significância p<0,05 foi considerado para os dois testes.
Outro critério adotado como limitante para a consideração da abundância diferencial foi a variação das médias da porcentagem do volume, sendo considerados os spots que variaram em no máximo de ½ valor para abundância diminuída e no mínimo de 2 vezes para abundância aumentada, entre as condições. Ainda como critério de inclusão dos spots como diferencialmente expressos, foi verificado se os spots estavam presentes em pelo menos 8 géis de cada condição (BIRON, 2006).
Triplicatas experimentais e biológicas de uma condição foram utilizadas como estudo piloto e foi utilizado o valor da porcentagem de volume de cada spot fornecidos pelo programa Image Master para calcular quantas replicatas experimentais e biológicas seriam necessárias, segundo o modelo de análise de potência descrito por Cairns, (2011). Os cálculos foram realizados utilizando o programa estatístico R e foi observada a média da variação experimental de 0,08 e a média da variação biológica de 0,9, o que demonstra uma variação nas replicatas
biológicas maior que nas técnicas, confirmando a reprodutibilidade técnica dos ensaios. Assim, para se obter um α=0,05 e β=0,8, e considerando-se a diferença de volumes entre os spots de no mínimo 2 vezes, as duplicatas experimentais mostraram-se adequadas quando o número de replicatas biológicas foi de 5 indivíduos. Além disso, o spot só foi considerado quando estava presente em pelo menos 8 dos 10 géis.