A fase de acasalamento teve duração máxima de 15 dias, que envolve pelo menos três ciclos estrais. Cada conjunto de quatro ratas foi colocado em gaiolas de polietileno, com cama de
maravalha, na presença de um rato macho não-diabético durante o período noturno. Este procedimento foi realizado até atingir o número de réplicas em cada grupo experimental. Na manhã subsequente, os machos foram retirados e os esfregaços vaginais das fêmeas foram colhidos. O fator indicativo de prenhez foi presença de espermatozóides (30) nos esfregaços contidos nas lâminas analisadas, sendo este considerado dia 0,5 de prenhez. Durante a prenhez, as fêmeas foram mantidas em gaiolas individuais.
Determinação glicêmica e de insulina sérica
No 18,5º dia de prenhez, amostras de sangue foram colhidas para determinação de glicemia e de insulina sérica (de acordo com as metodologias descritas acima nos dias que antecederam o período de prenhez).
Teste oral de Tolerância à glicose (TTG)
No 17,5º dia de prenhez, o TTG foi realizado de forma semelhante ao que foi exposto nos dias que antecederam o período de prenhez (D5, D15 e D90).
Análise histopatológica e imunoistoquímica do pâncreas
As amostras de tecido pancreático foram processadas e analisadas de forma semelhante ao que foi exposto nos dias que antecederam o período de prenhez (D5, D15 e D90).
6. Análise estatística
Os resultados foram estatisticamente analisados por ANOVA seguido do Teste de Comparações Múltiplas de Tukey ou do Teste t. Para todas as comparações foi considerado limite mínimo de significância estatística de p<0,05.
RESULTADOS
No 5° dia de vida (D5), as ratas que receberam a droga β citotóxica (streptozotocin) apresentaram glicemia maior em relação à dos animais do grupo controle. As ratas DMod tiveram menores níveis glicêmicos nos dias D15 e D90 em relação aos do dia D5 do mesmo grupo (Figura 1). Na fase adulta (90 dias e na prenhez), as ratas apresentaram maiores valores glicêmicos comparados aos das ratas controle (Figuras 1 e 2).
Figura 1. Média glicêmica de ratas controle e com diabete moderado (DMod) com 5, 15 e 90 dias de
vida.
Dados expressos como média ± desvio padrão.
*p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo Controle (Teste t). αp<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao dia D5 do grupo DMod (Teste de Comparações Múltiplas de Tukey).
Figura 2. Média glicêmica durante a prenhez de ratas controle e com diabete moderado (DMod).
Dados expressos como média ± desvio padrão.
Aos 90 dias de vida, as ratas DMod mostraram maiores porcentagens de hemoglobina glicada em relação às das ratas controle (Figura 3).
Figura 3. Porcentagem de hemoglobina glicada de ratas controle e com diabete moderado (DMod)
no 90º dia de vida.
Dados expressos como média ± desvio padrão.
As Figuras 4 e 5 mostram a curva do teste oral de tolerância à glicose (TTG) de ratas do grupo controle e diabete moderado com 85 dias de vida (Figura 4) e no 17º dia de prenhez (Figura 5). Após a sobrecarga de glicose, independentemente do período em que foi realizado o teste, foi verificado aumento nos níveis glicêmicos nas fêmeas do grupo DMod nos tempos 15, 30 e 60 minutos comparados aos das ratas controle.
Figura 4. Teste oral de tolerância à glicose (TTG) no 90o dia de vida de ratas controle e com diabete moderado (DMod).
Dados expressos como média ± desvio padrão.
*p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo Controle (Teste de Comparações Múltiplas de Tukey).
Figura 5. Teste oral de tolerância à glicose (TTG) no 17o dia de prenhez de ratas controle e com diabete moderado (DMod).
Dados expressos como média ± desvio padrão.
*p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo Controle (Teste de Comparações Múltiplas de Tukey).
Com relação à área das ilhotas pancreáticas, as ratas DMod apresentaram menor área das ilhotas em todos os períodos analisados comparados aos do grupo controle. Quando foi realizada a comparação intra-grupos, as ratas prenhes do grupo DMod apresentaram maior área comparada à das ratas do dia D15 (Figura 6).
Figura 6. Área média das ilhotas de ratas controle e com diabete moderado (DMod) nos dias 5, 15 e
90 de vida e no 18,5º dia de prenhez.
Dados expressos como média ± desvio padrão.
*p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo Controle (Teste t).
βp<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao dia D15 do grupo DMod (Teste de Comparações Múltiplas de Tukey).
Nas análises das imagens coradas com hematoxilina e eosina (HE), foi possível observar que as ratas DMod com cinco dias perderam a citoarquitetura das ilhotas pancreáticas e apresentaram extensões ao seu redor. Aos 15 e 90 dias de vida e no 18,5º dia de prenhez, as ratas DMod mostraram citoarquitetura similar à do grupo controle (Figura 7). A área das figuras foi representada pelo círculo em vermelho.
Figura 7. Fotomicrografia das ilhotas pancreáticas de ratas controle e com diabete moderado
(DMod) aos 5, 15 e 90 dias de vida e no 18,5º dia de prenhez (Coloração: Hematoxilina e eosina – HE, aumento 25X, 50 µm).
As concentrações de insulina sérica das ratas dos grupos controle e DMod estão representadas na Figura 8. As ratas adultas (D90 e 18,5º dia de prenhez) do grupo DMod apresentaram maiores concentrações de insulina sérica comparadas às das ratas DMod nos dias D5 e D15. No D15, houve diminuição e, no 18,5º dia de prenhez, aumento da concentração de insulina sérica nas ratas DMod em relação à das ratas controle (Figura 8).
Figura 8. Concentração de insulina sérica de ratas controle e com diabete moderado (DMod) nos
dias 5, 15 e 90 de vida e no 18,5º dia de prenhez. Dados expressos como média ± desvio padrão.
*p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo controle (Teste t).
αp<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao dia D5 do grupo DMod (Teste de Comparações Múltiplas de Tukey).
βp<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao dia D15 do grupo DMod (Teste de Comparações Múltiplas de Tukey).
Em relação à marcação positiva para insulina nas ilhotas pancreáticas, foi observado que, no dia D5, D15 e D18,5. As ratas com diabete moderado apresentaram diminuição do número de células marcadas para insulina comparado ao das ratas controle nos mesmo dias analisados. Comparando as ratas do grupo DMod, as ratas com 90 dias apresentaram aumento do número de células imunomarcadas para insulina em relação aos dias D15 e D5. As ratas com 15 dias mostraram mais células imunomarcadas comparadas as do dia 5. No 18,5º dia de prenhez, houve redução no número de células marcadas para insulina em relação ao dos dias D5 e D90 (Figura 9). Estas comparações podem ser observadas nas fotomicrografias das ilhotas pancreáticas marcadas para insulina apresentadas na Figura 10).
Figura 9. Numero de células imunomarcadas para insulina nas ilhotas pancreáticas de ratas controle
e com diabete moderado (DMod) nos dias 5, 15 e 90 de vida e no 18,5º dia de prenhez. Dados expressos como média ± desvio padrão.
*p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo controle (Teste t).
αp<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao dia D5 do grupo DMod (Teste de Comparações Múltiplas de Tukey).
βp<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao dia D15 do grupo DMod (Teste de Comparações Múltiplas de Tukey).
p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao dia D90 do grupo DMod (Teste de Comparações Múltiplas de Tukey).
Figura 10. Fotomicrografia das ilhotas pancreáticas com imunomarcação para insulina de ratas
controle e com diabete moderado (DMod) nos dias 5, 15 e 90 de vida e no 18,5º dia de prenhez (Aumento 25X, 50 µm).
O número médio de células imunomarcadas para o marcador de proliferação celular Ki-67 foi representado na Tabela 1. No grupo DMod, o numero médio de células imunomarcadas para Ki-67 foram menores no dia D15, D90 e D18,5 em relação ao do dia D5. O número de células imunomarcadas nas ratas do grupo DMod foi maior no D5 e menor no D15 em relação ao do grupo controle. (Tabela 1 e Figura 11).
Tabela 1. Número médio de células com imunomarcação positiva para insulina nas ilhotas pancreáticas de ratas controle e com diabete moderado (DMod) nos dias 5, 15 e 90 de vida e no 18,5º dia de prenhez.
*p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo controle (Teste t).
αp<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao dia D5 do grupo DMod (Teste de Comparações Múltiplas de Tukey).
Figura 11. Fotomicrografia das ilhotas pancreáticas com imunomarcação para Ki-67 em ratas
controle e com diabete moderado (DMod) nos dias 5, 15 e 90 de vida e no 18,5º dia de prenhez (Aumento 25X, 50 µm).
Em relação as células não β marcadas para GLP-1, as ratas DMod nos dias D5 e D15 apresentaram maior número de células imunomarcadas positivamente para GLP-1 em relação ao do grupo controle nos mesmos períodos. Na comparação intra-grupo do grupo DMod, foi observado menor número de células na fase adulta, independentemente da prenhez, comparado ao dos dias D5 e D15 (Figura 12A). As células β marcadas para GLP-1 apresentaram diminuição no número de células nos dias 5 e 15 quando comparado ao grupo controle. No grupo diabético, houve aumento no número de células de acordo com a idade do animal, e se estabilizou na vida adulta (D90 e prenhez) (Figura 12B).
A
B
Figura 12. Número de células imunomarcadas para GLP-1 nas ilhotas pancreáticas de ratas controle
e com diabete moderado (DMod) nos dias 5, 15 e 90 de vida e no 18,5º dia de prenhez. (A) Número de células não β imunomarcadas para GLP-1 nas ilhotas pancreáticas de ratas controle e com diabete moderado (DMod). (B) Número de células β imunomarcadas para GLP-1 nas ilhotas pancreáticas de ratas controle e com diabete moderado (DMod).
*p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo controle (Teste t).
αp<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao dia D5 do grupo DMod (Teste de Comparações Múltiplas de Tukey).
βp<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao dia 15 do grupo DMod (Teste de Comparações Múltiplas de Tukey).
As fotomicrografias das ilhotas pancreáticas das ratas controle e com diabete moderado (DMod) nos dias 5, 15 e 90 de vida e no 18,5º dia de prenhez estão apresentadas na Figura 13. A marcação das células não β para GLP-1 foi representada por setas pretas (periferia das ilhotas pancreáticas) e a marcação para GLP-1 das células β foram representadas por setas vermelhas (centro das ilhotas pancreáticas).
Figura 13. Fotomicrografia das ilhotas pancreáticas com imunomarcação para GLP-1 de ratas
controle e com diabete moderado (DMod) nos dias 5, 15 e 90 de vida e no 18,5º dia de prenhez (Aumento 25X, 50µm).
A morte por apoptose foi analisada utilizando como marcador a caspase-3 e esta representada nas Figuras 13 e 14. Foi observado que, independentemente do momento e dos grupos de estudo, maior numero de celulas com morte por apoptose nas células não β (Figura 15). O grupo DMod apresentou maior numero de células imunomarcadas para caspase-3 nos dias D5, D15 e D18,5 comparado ao das ratas controle nos mesmos momentos analisados. No grupo DMod, as ratas dos dias D90 e D18,5 mostraram menor número de células com morte por apoptose em relação ao do dia D15 e as ratas do dia D15 tiveram maior número de células imunomarcadas quando comparado ao do dia D5 (Figura 14).
Figura 14. Número de células imunomarcadas para caspase-3 nas ilhotas pancreáticas de ratas
controle e com diabete moderado (DMod) nos dias 5, 15 e 90 de vida e no 18,5º dia de prenhez. Dados expressos como média ± desvio padrão.
*p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo controle (Teste t).
αp<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao dia D5 do grupo DMod (Teste de Comparações Múltiplas de Tukey).
βp<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao dia D15 do grupo DMod (Teste de Comparações Múltiplas de Tukey).
Figura 15. Fotomicrografia das ilhotas pancreáticas com imunomarcação para Caspase-3 de ratas
controle e com diabete moderado (DMod) nos dias 5, 15 e 90 de vida e no 18,5º dia de prenhez (Aumento 25X, 50µm).
A Figura 16 representa as ilhotas pancreáticas de ratas marcadas para o anticorpo PDX-1 nos diferentes grupos e momentos de vida. Independentemente do grupo, no dia D5, foi possível observar imunomarcação nas ilhotas pancreáticas, ductos e ácinos. Nos dias D15, D90 e D18,5, a marcação para PDX-1 ficou mais evidente nas ilhotas pancreáticas nos diferentes grupos.
Figura 16. Fotomicrografia das ilhotas pancreáticas com imunomarcação para PDX-1 de ratas
controle e com diabete moderado (DMod) nos dias 5, 15 e 90 de vida e no 18,5º dia de prenhez (Aumento 25X, 50µm).
DISCUSSÃO
No presente estudo, foi verificado pela análise morfológica das ilhotas pancreáticas que, quatro dias após a administração da droga beta-citotóxica (streptozotocin), as ratas mostraram estrutura morfológica alterada, deixando de apresentar o formato arredondado para apresentar extensões a sua volta, abrangendo não somente as células do pâncreas endócrino, mas também células do ducto e dos ácinos. No 5º dia de vida, as ratas também apresentaram aumento dos níveis glicêmicos (superiores a 400 mg/dL) e diminuição do número de células beta (β). No entanto, foi observada proliferação celular aumentada em todo o pâncreas, sugerindo um mecanismo de regeneração compensatório como resposta à perda de células que ocorreu após a administração do
streptozotocin. A literatura evidencia que a replicação de células β é o primeiro mecanismo de
manutenção celular no período neonatal e que, provavelmente, há proliferação celular no caso da regeneração pancreática (22).
Com relação aos estudos realizados no 15º dia de vida de ratas que receberam
streptozotocin, o número de células em proliferação diminuiu, não apresentaram mais a
hiperglicemia, mas houve aumento do número de células marcadas para insulina em relação ao 5º dia de vida. Estudos demonstraram que, quando streptozotocin foi administrado na vida neonatal de ratos, estes animais apresentaram rápida remissão do diabete três a cinco dias após a administração da droga β citotóxica, mas desenvolveram o diabete moderado (glicemia entre 120 a 360 mg/dL) na vida adulta (31, 32). Nossos resultados mostraram que as ratas com 15 dias de vida tiveram aumento do número de células em apoptose, mais especificamente em células não β, pois a imunomarcação estava localizada na periferia das ilhotas pancreáticas. Além disso, foi verificado que, embora a concentração de insulina sérica e o número de células marcadas para insulina estivessem menores que o 5º dia de vida, os níveis glicêmicos estavam normais. Para justificar estes achados, podemos sugerir que, após a proliferação celular em toda a ilhota no 5º dia e para compensar o desequilíbrio hormonal existente nas ratas diabéticas, ocorreu uma transdiferenciação das células não β para células β no dia 15. Esta transdiferenciação também foi observada por Liang
et al. (21), que demonstraram que as células alpha (α) foram capazes de se desdiferenciar em
precursores de células β no pâncreas de ratos neonatos que receberam streptozotocin, levando estes animais a apresentar normoglicemia. Durante a fase adulta de ratas que receberam
streptozotocin, foi observado que o número de células marcadas para insulina e a concentração de
insulina sérica não apresentaram diferenças significativas em relação ao grupo controle. Entretanto estas células não foram suficientes ou a insulina produzida não foi eficaz para controlar a hiperglicemia estabelecida nas ratas diabéticas, confirmando as alterações glicêmicas encontradas.
Considerando as análises realizadas com o biomarcador PDX-1, a literatura demonstra que, durante o período embrionário, o PDX-1 é necessário para formação e maturação das ilhotas
pancreáticas, sendo expresso em todo o pâncreas (33). Neste trabalho, foi observado que a marcação para PDX-1 apareceu nos ácinos, ductos e ilhotas logo depois da destruição das células β pancreáticas (D5) e somente nas ilhotas nos outros dias analisados. Nossos resultados estão de acordo com os de Guo et al. (33) verificaram que, na vida adulta, este biomarcador não é mais expresso no pâncreas exócrino, tornando-se específico apenas para as ilhotas pancreáticas. Assim, sugerimos que, durante o período neonatal, as células pancreáticas ainda são imaturas e necessitam deste fator de transcrição para se tornarem maduras, porém não está claro como o PDX-1 atua neste processo de maturação das células pancreáticas, principalmente nas células β.
Além de estimular a expressão do fator de transcrição PDX-1, o hormônio GLP-1 promove aumento da proliferação e inibe a morte por apoptose de células β pancreáticas. No presente estudo, foi verificado que a imunomarcação para GLP-1 estava mais intensa em células não β, é sugerido que, as células α em pontos de clivagem expressam o pró-hormônio convertase que 1/3 (PC1/3), que resulta na produção local de GLP-1 (34, 35). Embora o GLP-1 estimulasse as células β a se proliferarem a partir do dia 15 de vida das ratas diabéticas, a proliferação destas células foi menor a partir deste dia e na fase adulta, mostrando que as células β não responderam diretamente ao estímulo de GLP-1 para se proliferarem. Entretanto, o fato das ratas diabéticas com 90 dias terem apresentado maior nível de insulina sérica e maior número de células marcadas para insulina está relacionado à maior imunomarcação de GLP-1, que estimulou a biossíntese e secreção de insulina pelas células β. Isto sugere que a secreção de insulina pelas células β na idade adulta (D90) foi devido à transdiferenciação das células não β em β visto que o número de células não β marcadas para apoptose foi reduzida, confirmando a ação de GLP-1 como inibidor de morte celular. Além disso, não foi verificada alteração na proliferação de células β pela marcação com Ki-67, confirmando a suposição da regeneração das células β por transdiferenciação das células não β para β durante a vida adulta.
Na prenhez de ratas diabéticas, o GLP-1 continuou estimulando as células β a sintetizar e secretar insulina, mas foi insuficiente para manter o nível de insulina, levando à hiperglicemia e presença de intolerância à glicose. Além disso, o número de células β marcadas para insulina reduziu drasticamente no grupo diabético.
No presente estudo, embora possa ter ocorrido regeneração entre os primeiros dias de vida e a fase adulta, os animais com 90 dias e na prenhez continuaram a apresentar área reduzida das ilhotas pancreáticas, hiperglicemia, intolerância à glicose e porcentagem aumentada de hemoglobina glicada. Já, na prenhez, houve diminuição de células imunomarcadas positivamente para insulina em relação aos 90 dias de vida do mesmo grupo e em relação o grupo controle. Além disso, as ratas prenhes diabéticas apresentaram aumento do número de células quiescentes. Associado às alterações já mencionadas, nosso grupo de pesquisa evidenciou que os animais com diabete moderado apresentaram aumento de lipoperoxidação, o que caracteriza um quadro de
estresse oxidativo exacerbado (dados não mostrados) e há evidências que estresse oxidativo é um fator estimulante para a célula se manter na fase G0 do ciclo celular (36). Desta forma, sugere-se que, com o aumento do estresse oxidativo nestas ratas, esteja ocorrendo um aumento do número de células quiescentes, reduzindo assim o número de células marcadas para insulina durante a prenhez.
Portanto, nossos resultados mostraram que, quando ratos neonatos receberam a droga β
citotóxica (streptozotocin), ocorreu destruição das células β pancreáticas, resultando em alterações na morfologia das ilhotas pancreáticas e, consequentemente, um quadro de hiperglicemia. Contudo, estas células conseguiram se regenerar e recuperam a estrutura da ilhota. Porém, esta regeneração foi parcial ou insuficiente visto que a área e o número de células marcadas para insulina permaneceram menores. Durante a vida adulta, o número de células positivas para insulina foi similar aos de ratas não-diabéticas, sugerindo que entre os 15 dias de vida e a fase adulta ocorreu uma nova onda de regeneração, fazendo com que os animais diabéticos apresentassem número de células que não diferissem dos animais controle. No entanto, quando as ratas foram submetidas a uma sobrecarga de glicose, as células produtoras de insulina de ratas diabéticas adultas não conseguiram manter a homeostase da glicose, levando a picos hiperglicêmicos no teste, caracterizando um quadro de intolerância à glicose.
CONCLUSÃO
Os biomarcadores utilizados neste estudo foram eficazes para demonstrar a regeneração das células β pancreáticas frente à destruição das mesmas, contudo esta regeneração não foi suficiente para compensar a perda de células causada no início da vida (período neonatal). Desta forma, é necessário compreender de forma mais aprofundada o processo de regeneração, como a conversão de uma célula não β para uma célula β, visando novas terapias a fim de diminuir as complicações causadas pelo diabete.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem Talísia Collachiti Moreto, pelo auxílio técnico no cuidado com os animais; Yuri K Sinzato, Bruna Dallaqua, Isabela L Iessi, pelas discussões sobre diabete moderado, e FAPESP, pela bolsa (Processo 2011/15606-6) e pelo auxílio financeiro concedidos (Processo 2011/18519-7).
REFERÊNCIAS
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