A técnica de amostragem DBS consiste na colheita de um pequeno volume de sangue obtido a partir de uma picada/punção na ponta do dedo ou no calcanhar (nas aplicações pediátricas), utilizando uma lanceta automática, estéril e descartável. O sangue pode ser colhido diretamente para o papel de filtro, ou através da utilização de microcapilares de precisão que em combinação com dispositivos próprios, permitem controlar o volume de sangue aplicado para produzir a mancha. As DBS podem igualmente ser obtidas a partir de um volume exato de sangue previamente colhido por venopunção, utilizando uma micropipeta (figura 1).
Figura 1 – Técnicas de amostragem utilizadas nas DBS: (a) aplicação do sangue diretamente do dedo ou
calcanhar para o papel de filtro; (b) recolha do sangue e aplicação no papel de filtro recorrendo a um capilar
de precisão; (c) aplicação no papel de filtro de um volume exato de sangue venoso com recurso a uma micropipeta.
(b)
(c) (a)
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As amostras obtidas diretamente a partir de uma picada, apresentam a vantagem de ser uma técnica pouco invasiva e facilmente realizada em ambiente não hospitalar e por técnicos minimamente treinados ou inclusive em casa pelos próprios pacientes, por exemplo em situações de monitorização terapêutica. (Déglon et al., 2012; Edelbroek et al., 2009) Contudo, é necessário ter em consideração alguns pormenores importantes relacionados com a forma como é feita a colheita, pormenores esses que podem afetar a qualidade das DBS. No procedimento de colheita direta do sangue, o dedo ou o calcanhar deve ser previamente desinfetado, nunca deve tocar o papel de filtro durante a colheita, a primeira gota deve ser rejeitada (para evitar fluídos tecidulares) e nunca se deve produzir manchas a partir da sobreposição de duas ou mais gotas de sangue, ou seja, sempre que uma gota tenha caído sobre o papel nunca se deve colocar nova gota sobre a primeira, mesmo que esta pareça pequena. Estes pormenores são importantes para evitar uma difusão não uniforme do sangue no papel, facto que pode ser crítico numa análise quantitativa. Por outro lado, a colheita direta apresenta como principal inconveniente o facto de não ser possível controlar o volume de sangue colhido. (McDade et al., 2014)
Ao contrário das amostras convencionais de sangue total, soro ou plasma colhidas por venopunção, as DBS não requerem o uso de anticoagulantes, não necessitam de ser centrifugadas, separadas, imediatamente refrigeradas ou até mesmo congeladas após a colheita. Uma vez colhidas, as manchas de sangue devem secar, à temperatura ambiente (15 – 22ºC), por um período mínimo de 2 a 3 horas ou durante a noite dependendo do tipo de papel e do volume de sangue utilizado. Deve-se evitar a exposição direta das manchas à luz solar e ao calor, não devem ser empilhadas e deve-se evitar o contacto com outras superfícies durante o processo de secagem. (Edelbroeck et al., 2009; Mei et al., 2001; Spooner et al., 2009; Quraishi et al., 2013) Posteriormente, as manchas são cobertas com um papel próprio para impedir o seu contacto
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com outras superfícies, e colocadas em bolsas de fecho zip pouco permeáveis ao ar ou envelopes hermeticamente fechados, de preferência revestidos de alumínio no caso de analitos sensíveis à luz, contendo saquetas de um agente excicante para proteger as amostras da humidade, uma vez que a sua presença induz o crescimento bacteriano, afeta a eficiência da extração durante a análise e facilita a degradação de analitos instáveis. Deste modo, as amostras estão preparadas para serem armazenadas à temperatura ambiente durante semanas, meses ou até anos, dependendo da estabilidade do analito. Para amostras que contenham analitos instáveis, ou para salvaguardar futuras aplicações, as amostras devem ser armazenadas a baixas temperaturas (refrigeradas ou até mesmo congeladas), sempre que possível. As amostras assim acondicionadas podem igualmente ser enviadas em condições de segurança para o laboratório. Uma cadeia de frio desde o local da colheita da amostra até ao laboratório não é necessário, uma vez que a maioria dos analitos permanece estável nas DBS à temperatura ambiente por um período de tempo de uma semana ou mais, sendo igualmente importante proteger as amostras da exposição ao calor. Uma vez que as amostras DBS são secas, representam um risco muito reduzido de infeção por agentes patogénicos, pelo que os regulamentos para o seu transporte são bastante menos exigentes, podendo ser facilmente enviadas através do sistema normal de correios. Deste modo, o seu envio para o laboratório é muito menos dispendioso em comparação com as amostras tradicionais de sangue total, soro e plasma. (McDade et al., 2014; Edelbroeck et al., 2009; Mei et al., 2001; Li et al., 2010)
Existem diversos tipos de papel de filtro que se podem utilizar na análise por DBS (figura 2). Os mais comuns são os papeis de filtro tradicionalmente utilizados na triagem de doenças metabólicas congénitas em recém-nascidos. Estes, são produzidos de acordo com os padrões de qualidade exigidos pelos laboratórios clínicos, a partir de fibras de algodão de elevada pureza constituídas essencialmente por celulose, com vista a obter uma correta e reprodutível absorção
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das amostras de sangue. O desempenho dos papeis de filtro utilizados para a colheita de sangue nos procedimentos de triagem neonatal é monitorizado pelo Newborn Screening Quality
Assurance Program (NSQAP) que verifica o processo de produção e assegura que os novos
lotes de papel cumprem todas as diretrizes estabelecidas por forma a garantir que o produto se comporta de forma semelhante ao lote anterior. (Edelbroeck et al., 2009)
Figura 2 – Exemplos de tipos de cartões utilizados nas DBS (Whatman ® 903; Whatman® BFC 180;
Whatman® FTA DMPK-A, B, ou C e o FTA Elute; Bond Elut DMS).
De entre os papeis de filtro de celulose, o papel Whatman® 903 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EUA) é o papel de filtro mais utilizado na colheita de amostras DBS. Foi originalmente desenvolvido no início da década de 1960 com o objetivo de facilitar a colheita de amostras a partir de uma picada no calcanhar de recém-nascidos (Guthrie e Susi, 1963). Este tipo de papel é muitas vezes designado por “cartões de Guthrie” em reconhecimento dos esforços despendidos pelo Dr. Robert Guthrie no desenvolvimento de métodos inovadores para a triagem de doenças metabólicas congénitas. Para além deste, existem outros papeis igualmente produzidos à base de celulose, nomeadamente: o Ahlström 226 (ID Biological Systems, Greenville, SC), o Sartorius TFN (Sartorius AG, Goettingen, Alemanha), o Whatman® BFC 180, o Whatman® FTA DMPK-A, B, ou C e o FTA Elute (GE Healthcare, Piscataway, NJ,
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EUA). Os cartões FTA DMPK são mais utilizados em estudos de farmacocinética e toxicocinética, enquanto que os FTA Elute são principalmente indicados para a colheita e análise de DNA. Todos os cartões DMPK estão disponíveis em dois formatos: normal ou com indicador. Os cartões com indicador são especialmente úteis para matrizes biológicas incolores, como por exemplo, a urina, o plasma, o fluído sinovial e cerebroespinal, uma vez que mudam de cor em contacto com a amostra. Os cartões FTA DMPK-A e B são quimicamente tratados com reagentes próprios que em contacto com a amostra promovem a lise das membranas celular e nuclear das células, a desnaturação das proteínas, a inativação das enzimas e impedem o crescimento bacteriano, conduzindo a uma maior estabilidade dos analitos. Contudo, existem algumas dúvidas relativamente à compatibilidade dos reagentes químicos utilizados no tratamento dos cartões com as técnicas de espectrometria de massa. (Keevil et al., 2011; Sharma et al., 2014) Pelo contrário, os cartões Whatman® BFC 180, FTA DMPK-C e Ahlstrom 226 não são submetidos a nenhum tipo de pré-tratamento, pelo que não possuem na sua composição substâncias químicas que possam interferir na análise. Por outro lado, existem os cartões Bond Elut DMS produzidos pela empresa Agilent Technologies (Santa Clara, CA, EUA), constituídos por um material diferente da celulose que, de acordo com o fabricante, reduz o efeito do hematócrito, a formação de ligações não-específicas, melhorando a resposta analítica nos espectrómetros de massa e aumentando a razão sinal/ruído (Hudson et al., 2011; Sharma et al., 2014). Contudo, este tipo de papel apresenta uma textura muito menos rígida o que torna o seu manuseamento mais difícil, nomeadamente no processo de remoção manual da mancha. (Sadones et al., 2014; McDade et al., 2014)
O volume de sangue tipicamente utilizado para produzir as DBS varia entre 5 e 100 µL. Contudo, é importante ter em atenção que as manchas de sangue produzidas a partir de volumes maiores, nomeadamente, valores superiores a 50 µL muito dificilmente se poderão obter a partir
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de uma punção no dedo ou calcanhar, pelo que estes volumes de sangue são utilizados em situações em que a aplicação do sangue no papel é feita a partir da pipetagem de um volume fixo de sangue colhido previamente por venopunção. As DBS preparadas a partir de medições volumétricas exatas são normalmente utilizadas em situações em que toda a mancha de sangue é analisada. Pelo contrário, quando as DBS são obtidas a partir da aplicação direta no papel através de uma punção ou picada, tipicamente um pequeno disco de papel (por exemplo, com um diâmetro de 3 a 6 mm, aproximadamente) é retirado da DBS para análise. A grande vantagem da análise realizada a partir da mancha completa é o facto de evitar em grande parte o efeito do hematócrito e simplificar o processo de validação do método. Pelo contrário, a análise parcial da DBS implica uma menor quantidade de amostra disponível para a análise, pelo que aumenta a necessidade de uma maior sensibilidade das técnicas analíticas utilizadas e a necessidade de um procedimento de validação mais elaborado. (Denniff et al., 2010) Curiosamente, a grande maioria das publicações disponíveis descreve a análise de DBS obtidas a partir da pipetagem de amostras de sangue venoso já existentes no laboratório, em detrimento de amostras obtidas a partir de sangue capilar. (Sadones et al., 2014)