1. Introduksjon
1.1. Del 1: Krise og beredskapsarbeid i en norsk kontekst
1.1.3. Politiets rolle i forebyggende beredskapsarbeid
O isolamento biodirigido de substâncias com atividade alelopática de
Aristolochia esperanzae está sumarizado nas Figuras 2.3 a 2.10. Para todos os
materiais vegetais, o extrato AcOEt foi o mais ativo, com atividade semelhante a do herbicida comercial GOAL® (Figuras 2.8-A a 2.10-A). Esta atividade foi detectada nas frações obtidas nas cromatografias subsequentes (Figura 2.8 a 2.10).
A partir da metodologia adotada, espera-se que estejam presentes na fração hexano substâncias de baixa polaridade, como ácidos graxos. Em contrapartida, espera-se que na fração água estejam presentes substâncias de alta polaridade, como açúcares. Na fração acetato de etila espera-se encontrar substâncias de polaridade intermediária, como fenóis, terpenóides, flavonóides e alcalóides, provenientes do metabolismo secundário da planta. Substâncias que apresentam atividade alelopática pertencem principalmente a esses grupos (KIM et al, 2005).
Os extratos aquosos de raízes e folhas maduras de A. esperanzae
apresentaram ação estimulante da elongação dos coleóptilos de trigo (Figuras 2.8-A e 2.9-A). Essa atividade pode ser explicada pela esperada maior concentração de açúcares nesses extratos, mas o estímulo pronunciado apresentado pelo extrato aquoso de folhas maduras (150% e 100% quando comparados ao controle nas concentrações 400 ppm e 200 ppm) sugere a possível presença de compostos com ação estimulante da multiplicação ou elongação celular do tecido vegetal testado.
FIGURA 2.8. Porcentagem de inibição ou estímulo do alongamento de fragmentos de coleóptilo estiolado de trigo (Triticum aestivum L.) sob a ação de diferentes frações do extrato bruto de raízes
de A. esperanzae e soluções do herbicida GOAL® em diferentes concentrações. Os valores são expressos como porcentagem do controle negativo. a Valores significativamente diferentes do controle negativo, de acordo com o teste de Welch a α = 0,05. b Valores não significativamente diferentes do controle positivo, de acordo com o teste de Welch a α = 0,05.
Devido a sua ação inibitória, os extratos AcOEt foram considerados os mais promissores para subsequentes fracionamentos e foram, então, submetidos a uma nova separação cromatográfica. As cinco frações obtidas para cada material vegetal e as frações obtidas nas separações cromatográficas posteriores foram submetidas a bioensaios com coleóptilo de trigo (Figuras 2.8 a 2.10).
Levando-se em consideração a atividade apresentada nos bioensaios com coleóptilos de trigo e a massa das amostras, optou-se por prosseguir o estudo fitoquímico das frações do extrato AcOEt de folhas maduras de A. esperanzae. A
partir da amostra FMA1, o isolamento biodirigido de substâncias com atividade
alelopática de folhas maduras de A. esperanzae levou à obtenção da amostra semi-
purificada ISO (Figura 2.6-B a 2.6-F). Esta amostra, apesar de apresentar atividade inferior à demonstrada pelas amostras FMD2A e FMD3b, quando analisada por CCD
mostrou-se composta pelas substâncias majoritárias encontradas nas outras duas amostras mais ativas (Figura 2.11).
FIGURA 2.9. Porcentagem de inibição ou estímulo do alongamento de fragmentos de coleóptilo estiolado de trigo (Triticum aestivum L.) sob a ação de diferentes frações do extrato bruto de folhas
maduras de A. esperanzae e soluções do herbicida GOAL® em diferentes concentrações. Os valores são expressos como porcentagem do controle negativo. a Valores significativamente diferentes do controle negativo, de acordo com o teste de Welch a α = 0,05. b Valores não significativamente diferentes do controle positivo, de acordo com o teste de Welch a α = 0,05.
FIGURA 2.10. Porcentagem de inibição ou estímulo do alongamento de fragmentos de coleóptilo estiolado de trigo (Triticum aestivum L.) sob a ação de diferentes frações do extrato bruto de folhas
jovens de A. esperanzae e soluções do herbicida GOAL® em diferentes concentrações. Os valores
são expressos como porcentagem do controle negativo. a Valores significativamente diferentes do controle negativo, de acordo com o teste de Welch a α = 0,05. b Valores não significativamente diferentes do controle positivo, de acordo com o teste de Welch a α = 0,05.
A diminuição da atividade dos compostos ao longo do fracionamento cromatográfico pode se dar por modificação química ou degradação dos compostos ativos, ou por atividade sinergística de dois ou mais compostos presentes nas frações semi-purificadas (DAYAN e DUKE, 2006). Como não foram observadas alterações no padrão de composição química nas amostras analisadas por CCD, acreditamos que esta perda de atividade tenha se dado por sinergismo das substâncias presentes na fração ISO, com as outras presentes nas frações semi- purificadas FMD2I e FMD3II.
FIGURA 2.11. Placas de CCD obtidas nas cromatografias da amostra FMC2, resultando nas amostras
FMD1 – FMD4, com as amostras mais ativas FMD2 e FMD3 indicadas pela seta (A) e da amostra
FMD3, resultando nas amostras FMD3b e ISO, esta última indicada pela seta (B). As placas foram
eluídas em mistura Hex / AcOEt 7:3. (Fotos: JATOBÁ, L. J., 2011).
FIGURA 2.12. Perfil cromatográfico por CLAE-UV da amostra ISO a 254 nm (A) e 280 nm (B).
A separação cromatográfica da amostra ISO por CLAE-UV resultou no perfil cromatográfico mostrado na Figura 2.12. As amostras ISOI, ISOII e ISOIII foram
coletadas, evaporadas à secura e a amostra ISOII foi submetida a análise por CLAE-
UV-MS. O cromatograma assim obtido mostrou três picos (P1, P2 e P3) com absorção no ultravioleta e espectro de massas como mostrado na Figura 2.13. Os três picos correspondem a três compostos isoméricos (4), (5) e (6), com fragmentos de massas com razão m/z 321 Da e 161 Da, e bandas de absorção no ultravioleta a
234 nm e entre 286 nm e 287 nm.
Uma pesquisa detalhada na literatura não permitiu encontrar uma estrutura molecular com dados espectroscópicos e espectrométricos similares aos encontrados para os isômeros presentes na amostra ISOII.
FIGURA 2.13. Cromatograma por CLAE-UV-MS da amostra ISOII e espectros de massas e absorção
no ultravioleta dos compostos (4), (5) e (6).
A amostra ISOII foi purificada por CLAE-UV, resultando nas frações
ISOII-P1 (3,8 mg), ISOII-P2 (0,3 mg) e ISOII-P3 (0,4 mg). O composto ISOII-P1 (4),
isolado como um sólido branco amorfo, foi analisado por diversos experimentos de ressonância magnética nuclear mono e bidimensionais: RMN-¹H, RMN-¹³C (BBD e DEPT), HMBC, HSQC e COSY-1H-1H (Anexos A a F), que possibilitaram estabelecer sua estrutura parcial (Figura 2.14, Tabela 2.1).
O espectro de RMN-¹H exibe quatro tripletos na região de 3 – 4 ppm, característicos de hidrogênios oximetínicos. A análise conjunta dos espectros RMN-
1H, RMN-13C, HSQC E COSY-1H-1H indicou um grupo CH
2 (δ ¹H 3,83 e 3,39, δ ¹³C
(δ ¹H 2,27, δ ¹³C 42,9). O hidrogênio deste grupo metino correlaciona-se com outro grupo metino (δ ¹H 1,84, δ ¹³C 51,5) substituído por um grupo CH2 ligado a um
substituinte não identificado (δ ¹H 2,62 e 2,49, δ ¹³C 33,4). O hidrogênio em δ ¹H 1,84 do último grupo metino também apresenta acoplamento com um grupo CH (δ ¹H 5,03, δ ¹³C 97,08) e um hidrogênio em δ ¹H 6,01 que, por sua vez, não exibe correlação direta com qualquer átomo de carbono. Pelo fato do hidrogênio em δ ¹H 6,01estar vizinho ao CH com δ 13C 97,8, atribuiu-se este hidrogênio a um grupo OH. O fato do carbono em δ 13C 97,8 estar substituído por dois oxigênios justificaria seu deslocamento químico (Figura 2.14-A).
FIGURA 2.14. Estrutura das subunidades 1 (A) e 2 (B) do composto presente na amostra ISOII-P1 (4)
com as respectivas correlações observadas nos espectros COSY-1H-1H e HMBC. X1, Y1, X2 e Y2 são
TABELA 2.1. Valores de deslocamentos químicos de RMN de ¹H (400 MHz) e ¹³C (100 MHz) e correlações a longa distância da substância presente na amostra ISOII-P1 (4) em DMSO-d6.
δ 13
C δ 1H (mult, J/Hz, integral) COSY-1H-1H HMBC
Subunidade 1 97,8 5,03 (t, 4,49 Hz, 1H) H2 C2, C3, C4 51,5 1,84 (m, 1H)* H1, H5a, H5b C3, C5 42,9 2,27 (m, 1H)* H4a, H4b, H5b - 71,0 a - 3,39 (t, 7,90 Hz, 1H) H3, H4b C1, C3 b - 3,83 (t, 7,90 Hz, 1H) H3, H4a C2 33,4 a - 2,49 (m, 1H)* H2 ? b - 2,62 (m, 1H)* H2 ? Subunidade 2 102,4 4,99 (m, 1H)* H2 C4 53,1 1,89 (m, 1H)* H1, H3, H5a, H5b C1 45,8 2,01 (m, 7,03 Hz, 1H) H2, H4a, H4b, H6 C2, C4, C5, C6 70,6 a - 3,56 (t, 8,30 Hz, 1H) H3, H4b C1, C2, C3, C6 b - 3,75 (t, 8,30 Hz, 1H, b) H3, H4a C1, C2, C3, C6 37,8** a - 2,38 (m, 1H)* H2 C2, C3 b - 2,55 (m, 1H)* H2 ? 38,2** 2,50 (m, 2H)* H3 ?
* Valores referentes ao centro do multipleto. ** Podem estar interconvertidos. ? Não foi possível a atribuição devido à grande sobreposição / proximidade de sinais.
A análise dos mesmos espectros indicou outro grupo CH2 (δ ¹H 3,56 e
3,75, δ ¹³C 70,6) acoplado com um grupo metino (δ ¹H 2,01, δ ¹³C 45,8). Este, por sua vez, mostra-se ligado a dois grupos, outro grupo metino (δ ¹H 1,89, δ ¹³C 53,1) substituído por um grupo CH2 (δ ¹H 2,55 e 2,58, δ ¹³C 37,8) ligado a um substituinte
desconhecido, e um grupo CH2 (δ ¹H 2,50, δ ¹³C 38,20) também ligado a um radical
não identificado. Devido à proximidade de sinais nos espectros bidimensionais, não foi possível determinar com clareza a posição dos carbonos em δ ¹3C 38,2 e δ ¹3C 37,8. Assim, as atribuições sugeridas na Tabela 2.1 e Figura 2.14-B podem ser interconvertidas. Além destes acoplamentos, o hidrogênio em δ ¹H 1,89 correlaciona-se diretamente com um grupo CH (δ ¹H 4,99, δ ¹³C 102,4) e um hidrogênio em δ ¹H 5,97 que, por sua vez, não exibe correlação direta com qualquer átomo de carbono. Pelo fato do hidrogênio em δ ¹H 5,97 estar vizinho ao CH com δ
13
102,4 estar substituído por dois oxigênios justificaria seu deslocamento químico (Figura 2.14-B).
Além das correlações descritas na determinação estrutural das duas subunidades do composto presente na amostra ISOII-P1, observa-se no espectro de
¹³C e DEPT desta substância 18 sinais referentes a carbonos sp2, sendo 10 CH (δ ¹³C 107,92, 107,98, 108,06, 108,79, 108,95, 109,16, 121,26, 121,36, 121,46 e 121,70) e 8 quaternários (δ ¹³C 133,88, 134,39, 134,98, 145,14, 145,26, 145,30, 147,14 e 147,20). Observa-se também, nos espectros de RMN-¹H e RMN-¹³C, a presença de sinais característicos de dois grupamentos -O-CH2-O- (δ ¹H 5,94-5,96,
δ ¹³C 100,55 e 100,62). A completa determinação da estrutura do composto ISOII-P1
não pode ser realizada por falta de dados que possibilitassem uma análise inequívoca. Espectros de RMN adicionais estão sendo obtidos, para que se possa conseguir informações complementares para a identificação do composto.
NAVICKIENE e LOPES (2001) isolaram um derivado hemiacetálico do 5-hidroximetilfurfural (7), a cis-N-feruloil-3-O-metildopamina (8), a partir da extração
com acetona de galhos de Aristolochia gehrtii. A ocorrência de compostos derivados
de fenetil (C6-C2) é significativa em A. gehrtii, a partir dos quais derivados
biosintéticos como o composto (8) podem ser formados.
FIGURA 2.15. Estruturas do 5-hidroximetilfurfural (7) e seu derivado hemicetálico cis-N-feruloil-3-O-
metildopamina (8). Fonte: NAVICKIENE e LOPES (2001).
2.4.2. Bioensaio de Fitotoxicidade
O isolamento dirigido por bioensaios com coleóptilos de trigo de substâncias com atividade alelopática em folhas maduras de Aristolochia esperanzae, realizado de acordo com MACÍAS et al. (2006) e MACÍAS et al. (2010),
levou à obtenção da fração ISO, utilizado no bioensaio de fitotoxicidade.
O trigo (Triticum aestivum L.) foi escolhido como espécie alvo para este
outras espécies comumente utilizadas, como alface, cebola ou agrião (MACÍAS et al., 2000). Os dados obtidos para o crescimento inicial de trigo apresentaram-se com
distribuição não-normal de acordo com o teste de Shapiro-Wilk a α = 0,05 e, então, o teste não-paramétrido de Welch a α = 0,05 foi utilizado para a comparação entre médias.
De acordo com experimentos preliminares, o herbicida GOAL, adotado nos bioensaios com coleóptilos de trigo, provocou a morte de quase a totalidade das plântulas testadas, impedindo assim a comparação dos resultados oferecidos com os obtidos para a fração testada. Assim, optou-se pelo herbicida comercial Sanson 40 SC® para o controle positivo, por apresentar-se menos tóxico que o herbicida GOAL® sob o desenvolvimento inicial das plântulas de trigo testadas.
FIGURA 2.16. Porcentagem de inibição ou estímulo do crescimento inicial da parte aérea (A) e sistema radicular (B) de trigo (Triticum aestivum L.) crescido sob a ação da fração ISO e do herbicida
Sanson SC 40® em diferentes concentrações. a Valores significativamente diferentes do controle negativo de acordo com o teste de Welch a α = 0,05.
A Figura 2.16-A apresenta os resultados para o crescimento da parte aérea das plântulas de trigo. A parte aérea destas plântulas não sofreu inibição do desenvolvimento na presença das soluções da fração ISO quando comparada ao controle negativo, com estímulo do crescimento na concentração intermediária (400 ppm). Embora não tenha apresentado inibição, as soluções da fração ISO provocaram anormalidades necróticas, um efeito diferente daquele apresentado pelo controle positivo (Figuras 2.16-A e 2.17). As plântulas anormais crescidas na presença do herbicida comercial Sanson SC 40® apresentaram pronunciada inibição do desenvolvimento e anormalidades não-necróticas, como geotropismo negativo e atrofia da parte aérea e do sistema radicular. Além disso, a ocorrência de plântulas anormais e o crescimento da parte aérea das plântulas de trigo na presença da fração ISO apresentaram efeito hormético (Figura 2.16-A e 2.17).
FIGURA 2.17. Porcentagem de plântulas de trigo anormais relativo ao controle negativo. a Valores significativamente diferentes do controle negativo de acordo com o teste de Welch a α = 0,05. Não houve diferença significativa entre os valores apresentados para as concentrações 400 ppm e 200 ppm de acordo com o teste de Welch (p < 0,05).
A hormese é um fenômeno amplamente reconhecido na área de alelopatia, relacionado à natureza espécie-específica da resposta alelopática, isto é, o fenômeno observado depende do aleloquímico específico e da espécie alvo adotada (AN, 2005; CALABRESE e BLAIR, 2009). O estímulo do crescimento na presença da fração ISO a 400 ppm pode ser explicada por realocação de recursos sob stress (CALABRESE e BALDWIN, 2003; CALABRESE, 2005). Assim, na maior
concentração (800 ppm), o efeito fitotóxico seria forte o suficiente para inibir o crescimento radicular e também o trade-off de recursos. A concentração
intermediária (400 ppm) inibiu o crescimento radicular mas não foi suficientemente forte para prevenir este trade-off. A concentração mais baixa não apresentou efeito
sobre o desenvolvimento radicular e não ofereceu condição estressante para que a planta necessitasse realocar recursos no desenvolvimento da parte aérea(FORBES, 2001). No entanto, com o aumento do comprimento médio da parte aérea das plântulas de trigo, aumentou também a área de contato deste tecido com as substâncias presentes nas soluções da fração ISO a 400 ppm e 200 ppm, o que poderia explicar o aumento na frequência de anormalidades necróticas.
A Figura 2.16-B apresenta os resultados para o crescimento inicial do sistema radicular de plântulas de trigo. Quando comparado ao controle negativo, o desenvolvimento radicular destas plântulas foi inibido tanto na presença de soluções da fração ISO quanto nas soluções do herbicida comercial Sanson SC 40®, apresentando-se como mais sensível do que o desenvolvimento da parte aérea.
FIGURA 2.18. Anormalidade necrótica na parte aérea de plântula de trigo crescida na presença da fração ISO. (Foto: JATOBÁ, L. J., 2011).
FIGURA 2.19. Plântulas de trigo crescidas sob a ação de soluções da fração ISO, de folhas maduras de A. esperanzae, a 200 ppm, 400 ppm, 800 ppm, e do controle negativo. (Fotos: JATOBÁ, L. J.,
2011).
Poucos estudos compararam o custo e eficiência de produtos para manejo de pragas agrícolas baseados em produtos naturais com pesticidas sintéticos (COPPING e DUKE, 2007). Apesar dos resultados apresentados pela fração ISO serem menos pronunciados do que os apresentados pelo herbicida Sanson SC 40® sobre o comprimento da parte aérea e o sistema radicular de plântulas de trigo, as anormalidades necróticas causadas pelos aleloquímicos presentes na fração ISO sugerem diferenças nos modos de ação bioquímicos de ambos. Assim, os aleloquímicos de folhas maduras de Aristolochia esperanzae
podem levar ao desenvolvimento de novos herbicidas, servindo como ferramentas importantes na prevenção de resistência aos herbicidas convencionais por parte das populações de plantas daninhas (DAYAN e DUKE, 2006; COPPING e DUKE, 2006).
2.5. Conclusões
1. O isolamento biodirigido de compostos com atividade alelopática em
Aristolochia esperanzae O. Kuntze levou à purificação de três compostos isoméricos
com fragmentos de massas com razão m/z 321 Da e 161 Da, e absorção no
ultravioleta em 234 nm e entre 286 nm e 287 nm.
2. Análises por RMN mono e bidimensionais de um destes compostos – composto (4), presente na amostra ISOII-P1 de folhas maduras – possibilitaram
estabelecer sua estrutura parcial.
3. A fração ISO apresentou atividade inibitória sobre o desenvolvimento inicial da parte aérea e do sistema radicular de trigo, além de ter provocado anormalidades necróticas na parte aérea destas plântulas por efeito de contato.
4. Apesar dos resultados apresentados pela fração ISO serem menos pronunciados do que aqueles apresentados pelo herbicida comercial Sanson 40 SC®, as diferenças de atividade observadas sugerem diferentes modos de ação bioquímica de ambos.
2.6. Referências
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CONCLUSÕES GERAIS
1. Os extratos AcOEt provenientes de raízes, folhas maduras e folhas jovens de A. esperanzae O. Kuntze foram os que apresentaram maior atividade
inibitória sobre a elongação de fragmentos de coleóptilo estiolado de trigo.
2. Os extratos AcOEt de raízes, folhas maduras e folhas jovens apresentaram atividade alelopática sobre o desenvolvimento inicial das espécies alvo testadas.
3. O estágio de maturação das folhas apresenta interferência na sua
atividade alelopática.
4. O extrato AcOEt de folhas maduras apresentou maior atividade inibitória no desenvolvimento inicial da parte aérea das espécies alvo, principalmente sobre eudicotiledôneas. Para amendoim-bravo, esta atividade foi semelhante ou superior à apresentada pelo herbicida comercial Sanson 40 SC®.
5. O extrato AcOEt de raízes foi o que apresentou maior atividade inibitória do desenvolvimento inicial do sistema radicular das plantas alvo testadas, com maior atividade sobre as duas espécies de monocotiledôneas. Para capim- arroz, esta atividade foi semelhante à apresentada pelo herbicida comercial Sanson 40 SC®.
6. O isolamento biodirigido de compostos com atividade alelopática em
Aristolochia esperanzae O. Kuntze levou à purificação de três compostos isoméricos