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o desenvolvimento do câncer têm sua expressão regulada pela hipermetilação do DNA. Com o objetivo de se avaliar a possibilidade desse mecanismo regular também a transcrição de lncRNAs intrônicos, células das linhagens tumorais DU-145, MCF-7 e Mia PaCa 2 foram tratadas com o agente desmetilante 5-aza-2’deoxicitidina (5-AZA) (Figura 2, subseção 3.4 da seção de Materiais

e Métodos). As condições de tratamento para obter a reexpressão de genes silenciados por metilação foram padronizadas como descrito na subseção 3.2 da seção de Materiais e Métodos. Amostras de RNA provenientes de duas réplicas biológicas independentes de cada linhagem celular tratada ou não com 5-AZA foram amplificadas e marcadas com os fluoróforos Cy5 e Cy3. Os alvos fluorescentes foram em seguida hibridizados em duplicata com as lâminas de oligonucleotídeos customizadas já descritas, trocando-se os fluoróforos em cada réplica técnica (Figura 4 da subseção 3.5.3 da seção de Material e Métodos). Na Tabela 15 estão discriminados os números de sondas expressas nas linhagens tratadas com 5-AZA por classe de transcrito.

Tabela 15: Número de sondas expressas em cada linhagem celular após tratamento com 5-AZA.

A Tabela 16 mostra a proporção de transcritos com expressão estatisticamente significativamente diferente após o tratamento das células com 5-AZA em relação às células controle (SAM – q-value < 10%). A desmetilação do DNA pelo tratamento com o agente desmetilante 5-AZA alterou a expressão de apenas uma pequena fração de genes codificadores de proteínas e de lncRNAs.

Tabela 16: Número de genes codificadores de proteínas e lncRNAs intrônicos antisseno e senso diferencialmente expressos após o tratamento de células das linhagens DU-145, MCF-7 e Mia PaCa 2 com 5-AZA.

Nas células de DU-145, apenas 6% dos mRNAs codificadores de proteínas expressos foram considerados como diferencialmente expressos após tratamento das células com 5-AZA em relação às células controle. Nas células da linhagem MCF-7, a porcentagem de mRNAs diferencialmente expressos após tratamento com 5-AZA foi um pouco maior, 10% dos expressos. Em Mia PaCa 2 foi observado o maior efeito do agente desmetilante, 26% dos mRNAs codificadores de proteínas expressos foram significativamente afetados pela adição da droga no meio de cultura. Dentre os afetados pelo tratamento com 5-AZA, de 68% a 78% deles apresentaram CGIs em até 2 kb do seu 5’UTR.

Em relação aos lncRNAs, o efeito do tratamento com o agente desmetilante 5-AZA foi ainda menor. Em DU-145, a proporção transcritos com expressão alterada após o tratamento foi de aproximadamente 2% do total de expressos, tanto para lncRNAs antissenso, como para os lncRNAs intrônicos senso. Em MCF-7, o tratamento com 5-AZA alterou a expressão de aproximadamente 3% dos lncRNAs antissenso e 6% dos lncRNAs senso. E em Mia PaCa 2, foi observada alteração de expressão em aproximadamente 11% dos lncRNAs antissenso e 10% dos

lncRNAs senso. Dentre estes lncRNAs intrônicos antissenso e senso afetados, cerca de 17% a 22% e 15% a 20% deles apresentaram CGIs em até 5kb de sua extremidade 5’ conhecida, respectivamente.

As listas dos 50 mRNAs, 50 lncRNAs antissenso e 50 lncRNA senso com maior diferença de expressão em cada linhagem estão apresentadas nas tabelas em anexo (Apêndices de 1 a 9).

Interessantemente, em DU-145 não encontramos nenhum gene ou lncRNA com expressão diminuída com significância estatística (q-value < 10%). Em MCF-7 e Mia PaCa 2, o número de transcritos com expressão diminuída após o tratamento foi muito pequeno. Apenas 12 genes codificadores de proteínas foram encontrados diminuídos em cada uma das linhagens, sendo nenhum deles comuns a ambas. Para lncRNAs, encontramos apenas dois transcritos diminuídos em MCF-7 e 11 em Mia PaCa 2, não sendo nenhum deles comuns a ambas as linhagens também. Muito provavelmente, essa diminuição na expressão após tratamento ocorreu devido a um efeito indireto do tratamento com 5-AZA.

Tanto os mRNAs codificadores de proteínas diferencialmente expressos quanto os lncRNAs antissenso e senso diferencialmente expressos mostram-se afetados de forma linhagem específica. A Figura 22 apresenta os diagramas de venn que mostram a baixa sobreposição de transcritos identificados como diferencialmente expressos entre as linhagens DU-145, MCF-7 e Mia PaCa 2.

Figura 22: mRNAs codificadores de proteínas e lncRNAs intrônicos diferencialmente expressos após tratamento com o agente desmetilante 5-AZA nas 3 linhagens. Os diagramas de venn mostram os

números de transcritos de cada classe que foram identificados como significativamente diferencialmente expressos (SAM q-value < 10%) após tratamento das linhagens DU-145, MCF-7 e Mia PaCa 2 com 5- AZA.

Entre os 2.825 mRNAs codificadores de proteínas diferencialmente expressos em pelo menos uma das três linhagens, somente 78 (3%) foram considerados como diferencialmente expresso nas três análises. Para os lncRNAs intrônicos a sobreposição foi de apenas 1% (7 de 555) e 2% (7 de 404) dos transcritos antissenso e senso, respectivamente.

Sobrepondo nossas listas de mRNAs diferencialmente expressos após o tratamento com o agente desmetilante do DNA (5-AZA) com as listas de genes já identificados em outros trabalhos como regulados por metilação do DNA e disponíveis publicamente no banco de dados PubMeth (Ongenaert et al., 2008), encontramos uma pequena sobreposição. Do total de 362 genes diferencialmente expressos na linhagem de carcinoma de próstata DU-145, 6 já foram descritos como regulados por metilação do DNA em tumores de próstata. Oito dos 651 genes diferencialmente expressos na linhagem de adenocarcinoma de mama MCF-7, e 10 dos 1612 genes diferencialmente expressos na linhagem de carcinoma de pâncreas Mia PaCa 2, já foram descritos como regulados por metilação do DNA em tumores . A pequena sobreposição pode ser

explicada pela característica linhagem/tecido específica da metilação do DNA, e pela quantidade limitada de dados disponível no banco PubMeth.

Com o objetivo de investigar a presença de categorias biológicas específicas associadas com os genes regulados por metilação do DNA presentes em nossas análises usamos o software Ingenuity Pathway Analysis (http://www.ingenuity.com). Esta ferramenta foi utilizada para identificar redes de interações gênicas associadas a categorias biológicas funcionais contendo genes diferencialmente expressos após o tratamento com o agente desmetilante 5-AZA.

As 10 categorias biológicas funcionais e as 10 categorias de associação com doença/desordem mais relacionadas com os 392, 651 e 1.612 genes codificadores de proteínas cuja expressão foi regulada pelo tratamento com 5-AZA em DU-145, MCF-7 e Mia PaCa 2, respectivamente estão mostradas na Figura 23. A categoria biológica funcional e a doença mais associada com os genes diferencialmente expressos após tratamento com 5-AZA nas três linhagens foram “Cellular Movement” e “ Cancer”, respectivamente.

Figura 23: Top 10 categorias biológicas funcionais e doenças/desordens associadas aos genes codificadores de proteínas significativamente diferencialmente expressos após tratamento com o agente desmetilante 5-AZA. (A) Top 10 categorias biológicas funcionais e (B) top 10 doenças/desordens

associadas com os 392 genes afetados pela desmetilação do DNA em DU-145. (C) Top 10 categorias biológicas funcionais e (D) top 10 doenças/desordens associadas com os 651 genes afetados pela desmetilação do DNA em MCF-7. (E) Top 10 categorias biológicas funcionais e (F) top 10 doenças/desordens associadas com os 1.612 genes afetados pela desmetilação do DNA em Mia PaCa 2. A ferramenta Ingenuity Pathways Analysis calcula um p-value baseado na probabilidade de se obter o número de moléculas associadas às categorias de um dataset ao acaso. Nesta análise, o p-value foi corrigido utilizando a correção para múltiplos testes B-H. A linha threshold corresponde à –log(B-H p-

4.8 Seleção de lncRNAs intrônicos regulados por metilação do DNA para validação