Planleggingsprosessen

Após o redirecionamento do reator para o tratamento de glicerol, foi proposta a análise dos SMP produzidos durante o consumo desse substrato, visando à comparação entre esses e os liberados na degradação de glicose.

Para a análise de SMP, a solução do interior do reator UASB tratando glicerol puro foi filtrada e concentrada por liofilização. No entanto, após a sublimação da água, a amostra ainda apresentava grande quantidade de bicarbonato de sódio. Devido à acidificação do meio durante a degradação de glicerol, o sal era adicionado como medida de controle do pH. Para a eliminação do bicarbonato, foram testados dois protocolos: diálise ou precipitação seguida de diálise. Todavia, nenhuma das alternativas mostrou-se efetiva para a recuperação de proteínas passíveis de serem visualizadas com a coloração por Coomassie.

Desse modo, apenas amostras de proteínas celulares foram analisadas, com o intuito de avaliar mudanças na comunidade microbiana relacionadas a alterações de substrato. Assim, foram preparados extratos do lodo usado como inóculo, alimentado apenas com glicose, e do lodo do reator em duas fases: uma tratando glicerol puro ou outra resíduo de biodiesel. Os perfis proteicos das preparações podem ser vistos na figura 15 e as bandas identificadas são mostradas na tabela 8. Infelizmente, nenhuma proteína foi identificada para o extrato do inóculo.

Figura 15: SDS dos extratos de proteínas celulares. M- marcador de massa molecular; In- inóculo; RA- reator tratando glicerol puro; RP- reator tratando resíduo de biodiesel.

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Das 6 proteínas (Tabela 8) identificadas nessa etapa, 4 delas correspondem a proteínas de membrana. Hanreich e colaboradores (2013), ao buscarem proteínas responsáveis pela degradação de carboidratos em lodo anaeróbio, encontraram grande número de proteínas membranares e periplasmáticas. Segundo os autores, a elevada taxa de identificação de proteínas desse tipo deve-se ao fato de que essas compreendem aproximadamente 30% do total de proteínas celulares. Além disso, o método de extração empregado – o qual foi usado também em nosso trabalho – pode favorecer a presença de proteínas mais hidrofóbicas (como as de membrana) em detrimento a proteínas citoplasmáticas, de maior hidrofilicidade.

Tabela 8: Proteínas identificadas para os extratos celulares separados por SDS-PAGE. RA-

reator tratando glicerol puro; RP- reator tratando resíduo de biodiesel.

Lodo Amostra Identificação Micro-organismo

RA r1 Proteína hipotética Clostridium sp.

Beta-glicosidase Aspergillus aculeatus

RP

r2 Flagelina Escherichia coli

r3 FlaB3 Treponema pallidum

r4 Proteína ligante de soluto extracelular Enterobacter sp.

r5 Proteína fimbrial MrKA Klebsiella oxytoca

O elevado número de proteínas, junto ao background intenso, torna difícil o levantamento de suposições acerca de mudanças relacionadas às diferentes condições ambientais a que o lodo foi exposto. Apenas na região inferior a 30 kDa nota-se com clareza algumas bandas que apresentam maior intensidade para os extratos das células envolvidas no tratamento de glicerol. Isso indica a expressão aumentada dessas proteínas ou o enriquecimento de um determinado grupo de micro-organismos que teria o crescimento favorecido nessas condições. Das bandas excisadas nessa região, as bandas ‘r5’ e ‘r4’, foram classificadas como proteína fimbrial MrkA de Klebsiella oxytoca e proteína ligante de soluto extracelular de Enterobacter sp., respectivamente.

A proteína MrkA é codificada por um dos cinco genes do cluster mrkABCDF, sendo a principal componente estrutural da fimbria tipo 3 (STAHLHUT et al., 2012). Segundo Schurtz e colaboradores (SCHURTZ et al., 1994), o gene mrkA, diferentemente de outros

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componentes do cluster, é altamente conservado entre espécies do gênero Klebsiella. Além de seu papel estrutural, a alta hidrofobicidade dessa proteína facilita interações bacterianas, propiciando a formação do biofilme. Essa característica mostra-se fundamental para a adesão e o crescimento de células de Klebsiella sp., visto que essas não possuem flagelos, outro apêndice extracelular importante para o desenvolvimento de aglomerados bacterianos (LANGSTRAAT et al., 2001). A ocorrência dessa proteína na microbiota do reator tratando glicerol, principalmente naquele alimentado com glicerol bruto, indica que espécies de

Klebsiella podem ser importantes para a degradação desse resíduo. Esse achado corrobora com os dados de Homann e colaboradores (1990), os quais, com uso de meios seletivos para micro-organismos consumidores de glicerol, isolaram espécies dos gêneros Citrobacter e

Klebsiella, entre elas K. oxytoca. Os autores destacaram o rápido consumo de glicerol e a alta taxa de crescimento dos isolados de Klebsiella nessa fonte de carbono. Somado a esse fato, o metabolismo desses micro-organismos possibilita a conversão pH dependente de glicerol em ácido acético e 2,3-butanodiol. A produção desses compostos serve como um sistema de tamponamento do meio em uma faixa de pH em torno de 5,4 e pode ser considerada como uma estratégia de sobrevivência microbiana (PETROV e PETROVA, 2009). Esse fato explicaria tanto a vantagem desses micro-organismos em ambientes contendo glicerol quanto a acidificação da solução no interior do reator UASB usado em nosso estudo.

De maneira similar, bactérias do gênero Enterobacter, usadas na produção de hidrogênio a partir de glicerol, apresentam pH ótimo de crescimento entre 5,8 e 7,0. Essas bactérias possuem diferentes rotas metabólicas que possibilitam o uso de glicerol como fonte de energia bem como sua conversão em metabólitos de interesse comercial. Devido a essa característica, muitas espécies de Enterobacter são isoladas em meios de cultura contendo glicerol visando à conversão de resíduos de biodiesel em combustíveis renováveis como: hidrogênio e etanol (REUNGSANG et al., 2013). A proteína encontrada, identificada como uma transportadora ABC (ATP Binding Casset) de cisteína, apesar de não estar diretamente relacionada à degradação de glicerol, pode ter relação com o aumento da população de

Enterobacter sp.no reator. Essa proteína pertence à família de ligantes de soluto extracelular a qual, em bactérias gram-negativas, é composta de proteínas periplasmáticas envolvidas nos fenômenos de quimiorrecepção e transporte transmembrana (TAM e SAIER, 1993). Em condições de disponibilidade de nutrientes no meio, o uso de transportadores ABC mostra-se energeticamente mais favorável do que a síntese desses nutrientes, acarretando no aumento da

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taxa de crescimento microbiana. É importante ressaltar a grande similaridade entre transportadores desse tipo, e que essa não significa necessariamente similaridade entre substratos (HIGGINS, 1992). No reator em estudo, esses não estariam envolvidos no transporte de glicerol, já que esse é o único carboidrato conhecido que é transportado via difusão facilitada em bactérias (DILLS et al., 1980).

Para a banda ‘r1’ duas proteínas foram identificadas: uma delas como sendo uma proteína hipotética de Clostridium sp. e outra como uma β-glicosidase de Aspergillus

aculeatus. A presença do gênero Clostridium é descrita não apenas para biorreatores tratando glicerol como também para outros resíduos (YAZDANI e GONZALEZ, 2007). Por outro lado, a ocorrência de fungos não é comum nesses ambientes e, portanto, esse resultado pode ser explicado pela similaridade entre essa classe de enzimas microbianas. Gräbnitz e colaboradores (1989) reportaram a alta homologia entre as sequências de nucleotídeos do gene que codifica para β-glicosidase de Clostridium thermocellum e genes de leveduras e fungos filamentosos. Por outro lado, no sistema em estudo, essa enzima não apresenta função evidente, visto sua atividade sobre material celulósico de cadeia curta (BHATIA et al., 2002). Proteínas atribuídas a micro-organismos potencialmente patogênicos foram encontradas nas bandas ‘r2’ e ‘r3’. A primeira delas foi identificada como uma flagelina de

Escherichia coli. Como o lodo usado para inóculo do reator é originado de uma estação que trata esgoto doméstico é provável que esse micro-organismo esteja presente. No entanto cabe informar que membros da família Enterobacteriaceae, dentre eles a espécie Escherichia coli, são membros freqüentes em processos de digestão anaeróbia e também foram relatados como fermentadores de glicerol a diversos produtos orgânicos além de biogás (H2 e CO2;

ALMEIDA et al., 2012). Considerando tais informações, a identificação de uma proteína específica de E. coli sugere seu envolvimento na biodegradação do glicerol. A outra proteína referente a um patógeno foi identificada como a proteína FlaB3, uma das componentes do flagelo, de Treponema pallidum. Não foram encontrados relatos sobre o monitoramento e a sobrevivência desse micro-organismo em reatores anaeróbios, porém observações microscópicas do lodo de inóculo frequentemente revelavam morfologia celular semelhante a de Treponema (SILVA, comunicação pessoal) sugerindo sua presença nos reatores anaeróbios aplicados ao tratamento de esgoto doméstico. Uma vez que, um dos parâmetros a serem avaliados em estações de tratamento é a capacidade de eliminação de patógenos, inclusive daqueles não cultiváveis (JIANG et al., 2012), encontrar proteínas referentes a esses micro-

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organismos mostra a funcionalidade da técnica também no monitoramento de micro- organismos indesejáveis.

Com o intuito de identificar um maior número de proteínas, as três preparações (Inóculo, RA e RP) foram submetidas à digestão em solução. As proteínas identificadas são mostradas na tabela 9.

Tabela 9: Proteínas identificadas para os extratos celulares submetidos à digestão em

solução. In- inóculo; RA- reator tratando glicerol puro; RP- reator tratando resíduo de biodiesel.

Lodo Identificação Micro-organismo

In Elastase III A Homo sapiens

RA

Proteína putativa fimbrial-símile Klebsiella pneumoniae

Proteína fimbrial MrKA Klebsiella oxytoca

Proteína A de membrana externa Citrobacter freundii

RP

Proteína fimbrial MrKA Klebsiella oxytoca

Proteína putativa fimbrial-símile Klebsiella pneumoniae

Gliceraldeído-3-fosfato Desidrogenase Escherichia vulneris

Proteína hipotética Citrobacter koseri

Flagelina Clostridium trobutyricum

Mais uma vez, nenhuma proteína microbiana foi identificada para o extrato do inóculo. Curiosamente, foi encontrada a enzima elastase III A de Homo sapiens, uma das isoformas das elastases pancreáticas humanas responsáveis pela hidrólise de proteínas fibrosas, como a elastina. Em um estudo sobre proteínas EPS de lodo ativado de estações de tratamento reais, Park e colaboradores (2008) reportaram a ocorrência da elastase III A em três bandas analisadas por LC-MS/MS. Os autores discutiram que a enzima não sofre degradação no trato digestivo humano e que ficaria adsorvida na matriz extracelular dos flocos. Em nosso trabalho, a identificação dessa enzima indica que essa é extremamente resistente aos dois tipos de tratamento biológico (aeróbio e anaeróbio), pois o lodo analisado, após sua coleta, foi alimentado por aproximadamente doze meses apenas com glicose. Além

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disso, esse achado indica que o método escolhido para a análise de proteínas intracelulares não é isento de contaminações por proteínas EPS.

Para o reator tratando glicerol, a proteína MrKA de K. oxytoca, já identificada na banda ‘r5’, foi detectada em ambas as fases, assim como uma proteína putativa fimbrial- símile de Klebsiella pneumoniae. A recorrência dessa identificação reforça a hipótese de enriquecimento desse gênero no reator.

Citrobacter sp. também foram detectados nas duas fases, sendo que na primeira foi identificada a proteína A da membrana externa (OmpA) de C. freundii. Representantes dessa espécie também foram encontrados por Homman e colaboradores (1990) entre os isolados obtidos em meio seletivo para micro-organismos consumidores de glicerol. Segundo os mesmos autores, a espécie mostra-se atrativa para a bioconversão de glicerol em 1,3- propanodiol (composto empregado industrialmente para a produção de polímeros), visto que a geração de subprodutos é mínima. Quanto a OmpA, Torres e colaboradores (2006) reportam seu alto nível de expressão em E. coli e sua ocorrência em outras bactérias gram-negativas. Além de sua função estrutural, a OmpA exerce papel na aderência bacteriana. Outra proteína de membrana externa encontrada, dessa vez na segunda fase do reator, foi uma flagelina de

Clostridium tyrobutyricum, micro-organismo também envolvido na degradação de glicerol (YAZDANI e GONZALEZ, 2007).

Também na segunda fase, foi encontrada uma proteína hipotética de Citrobacter

koseri, espécie patogênica ainda não reportada para processos de tratamento de resíduos. A busca de homologia pelo algoritmo BLAST, revelou identidade de 94% da sequência da proteína detectada com a glicerol-desidrogenase de Citrobacter sp. Essa enzima é a primeira a atuar na via oxidativa de degradação do glicerol, convertendo-o a di-hidroxiacetona, sendo de extrema importância para a obtenção de energia pela comunidade microbiana do reator. Após outras conversões, a di-hidroxiacetona é encaminhada à glicólise, via para a qual foi encontrada a enzima gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase de Escherichia vulneris, outra espécie não reportada para reatores anaeróbios. A sequência encontrada apresenta alta similaridade com a sequência da mesma enzima de K. pneumoniae, espécie com maior probabilidade de estar presente no reator.

A indicação da abundância de micro-organismos fermentativos condiz com a condição do reator no momento da coleta. Dados de monitoramento indicam alta produção de ácidos orgânicos com consequente queda do pH e diminuição da atividade dos micro-organismos

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metanogênicos, verificada pela baixa produção de CH4. Tais condições também explicariam a

ausência de identificação de proteínas de arqueias metanogênicas, verificadas em grande número em outros trabalhos (ABRAM et al., 2011; HANREICH et al., 2013).

A baixa porcentagem de identificação de proteínas em nosso trabalho pode estar relacionada à escassez de sequências genômicas depositadas para micro-organismos de lodo anaeróbio, visto que, através da análise manual de muitos espectros MS e MS2 o sucesso da digestão enzimática e da fragmentação dos peptídeos pôde ser verificada. Em trabalhos recentes é comum a aplicação de técnicas metagenômicas para a geração de banco de dados, contra os quais os resultados de espectrometria de massas possam ser comparados (ALBERTSEN et al., 2013; HANREICH et al., 2013). Outra alternativa para a identificação de proteínas referentes a esses espectros é o sequenciamento de novo desses e posterior busca em banco de dados.