Os testes de pHs para holocelulases (celulases, hemicelulases e pectinases) de Aspergillus crescidos nos três substratos lignocelulósicos pré-tratados mostraram que o A. oryzae crescido em engaço de bananeira (T14) foi o que obteve os melhores resultados (Figura 5).
Na avaliação do efeito de pH para xilanase, os melhores resultados foram obtidos no tampão acetato de sódio 50 mM, na faixa entre 5 e 5,5 (Figura 5). Esta mesma faixa foi observada nos resultados da xilanase do cultivo em SmF (Figura 3), tendo A. oryzae crescido em engaço de bananeira no cultivo SSF o maior destaque. Porém, a faixa de pH para este grupo de enzimas foi estendida entre 4,0 e 9,0, com valores de 60% ou mais da atividade máxima obtida por A. oryzae em engaço de bananeira, nos três tampões testados (Figura 6). A atividade de xilanase para os demais tratamentos seguiu o desenho gráfico do tratamento de A. oryzae em engaço de bananeira, porém, os que estiveram mais próximos (E. nidulans crescidos em bagaço de cana-de-açúcar, engaço de bananeira e piolho-de-algodão-sujo) não chegaram a 70% do tratamento citado, em pH 5,0 (Figura 5).
Figura 5. Efeito do pH nas atividades de celulases (CMCase, FPase e avicelase), hemicelulases
(xilanases e mananases) e pectinase dos extratos brutos dos Aspergillus crescidos em diferentes fontes de carbono lignocelulósicas nas condições de SSF.
A atividade de xilanase nos tampões fosfato de sódio e Tris-HCl não apresentou diferenças relevantes entre os tratamentos com A. oryzae em engaço de bananeira e com os tratamentos de E nidulans. Porém, A. terreus crescido nos três substratos apresentou atividade irrelevante de xilanase (Figura 5), principalmente quando crescidos em piolho-de-algodão-sujo, em todas as faixas tamponantes utilizadas, diferentemente dos resultados apresentados no cultivo submerso, tendo o engaço de bananeira o substrato com resultados mais expressivos (Figura 3). A xilanase de A. terreus produzida em meio sólido com farelo de trigo apresentou faixa de pH entre 4 e 7 (Ghanem et al., 2000). Valores de pH entre 1 e 10 foram relatados por Beg et al. (2001), para fungos do gênero Aspergillus, em revisão sobre as aplicações industriais das xilanases microbianas. Contudo, a faixa predominante de pH ótimo para xilanases desses microrganismos foi entre 5 e 6.
Mananase teve, com A. oryzae crescido em engaço de bananeira, o melhor resultado para o efeito do pH dentre os tratamentos no cultivo SSF (Figura 5). Os resultados do A. oryzae em engaço de bananeira apresentaram atividade mananolítica em ampla faixa de pH, nos três tampões testados. Observou-se que tanto no tampão fosfato de sódio quanto no Tris-HCl, ambos a 50 mM, os melhores resultados ficaram entre pHs 6 e 7, respectivamente (Figura 5). Porém, a mananase também tem atividade significativa em pHs abaixo de 5 em tampão acetato de sódio, como apresentado no cultivo SmF (Figura 3).
Resultados decrescentes de atividade enzimática de mananase foram observados na faixa de pH entre 5,5 e 6,0, no tampão acetato de sódio, mostrando que há influência do tampão nesta faixa de pH. Os demais tratamentos, nos três tampões, na faixa de pH de 3,0 a 9,0, de forma geral, não tiveram atividade de mananase relevante (Figura 5). A maioria dos tratamentos não chegou a atingir 30% da atividade de A. oryzae crescido em engaço de bananeira (T14). Valores
próximos destes pHs para este grupo de enzimas foram relatados por Moreira & Ferreira-Filho (2008), para os fungos do gênero Aspergillus apresentando pHs ótimos entre 3,0-6,0, porém, com predominância do pH 4,5. Os Aspergillus cultivados neste trabalho, no sistema SSF, em algumas fontes de carbono lignocelulósicas, apresentaram faixa de pH ótimo mais ampla, chegando com atividades significativas até pH 7,5 no tampão Tris-HCl (Figura 6).
Os resultados para pectinase mostraram maior atividade enzimática nas faixas ácida e neutra (Figura 5), diferenciando dos resultados no cultivo SmF, que mostraram um perfil alcalino para maioria dos tratamentos, principalmente A. terreus-engaço (T4) (Figura 3). O cultivo de A.
oryzae crescido em engaço de bananeira destacou-se na atividade de pectinase em pH 4,0,
mantendo mais de 85% da atividade na faixa ácida que variou 3,5 a 5,0 em tampão acetato de sódio 50 mM (Figura 5). Esse cultivo apresentou atividade de pectinase em torno de 70% no pH 6 do tampão fosfato de sódio, enquanto no tampão Tris-HCl, com mesma concentração dos demais tampões, o resultado mais expressivo foi na faixa tamponante de 7 a 7,5, apresentando, assim, os mesmos resultados observados no tampão acetato de sódio em pH 4.
A faixa alcalina de atividade pectinase de A. oryzae crescido em engaço de bananeira ficou próxima de 70% da atividade obtida na faixa ácida. O cultivo de A. terreus em piolho-de- algodão-sujo apresentou o mesmo desenho gráfico que A. oryzae crescido em engaço de bananeira, porém, com, aproximadamente, 62% da atividade máxima de pectinase observada em
A. oryzae (Figura 5). O cultivo de A. oryzae crescido em piolho-de-algodão-sujo apresentou, em
tampão Tris-HCl pH 7,0, atividade de pectinase próxima a 70%, quando comparado com os melhores resultados.
O resultado para CMCases apresentou, no cultivo de A. oryzae crescido em engaço de bananeira, atividades expressivas na faixa ácida, tendo em pH 4,5 o seu melhor resultado, (Figura 5), sendo a mesma faixa observada no cultivo SmF (Figura 3). O melhor resultado da atividade de CMCase de A. oryzae crescido em engaço de bananeira em tampão fosfato de sódio foi observado em pH 6,0, porém, com menos de 65% da atividade máxima observada. Os demais cultivos não apresentaram diferenças significativas entre si, apresentando atividade de CMCase inferiores a 50% das atividades do cultivo de A. oryzae em engaço de bananeira (Figura 5). Para a faixa tamponante alcalina em tampão Tris-HCl, os resultados foram insignificantes para todos os cultivos.
Segundo Khalil (2002), P. chrysosporium BKM-F-1767 crescido em bagaço de cana-de- açúcar (1%), apresentou pH ótimo para CMCase em tampão acetato de sódio 100 mM, em torno de 4,5, porém, mostrou, na faixa de pH entre 4,0 e 5,0, mais de 85% da atividade enzimática. Bukhtojarov et al. (2004) demonstraram que o fungo Chrysosporium lucknowense teve máxima atividade enzimática de endoglicanase e celobio-hidrolase em tampão ácido, sendo o pH ótimo entre 4,5 e 6,0. Os autores chamam a atenção para o fato de que duas endoglicanases mantiveram atividades de 55% a 60% até o pH 8,5. Estes autores ressaltam que altas atividades em pH neutro ou alcalino são raramentes encontradas entre celulases fúngicas, similar aos resultados encontrados neste trabalho com fungos do gênero Aspergillus crescidos em alguns resíduos lignocelulósicos como fonte de carbono.
Segundo Silva et al. (2005), o fungo termofílico Thermoascus aurantiacus, quando crescido no sistema SSF usando diferentes resíduos agrícolas sem enriquecimento do meio, apresentou mais atividade xilanolítica que celulolítica. Este fungo teve seu melhor desempenho em sabugo de milho, palha de milho e grama-batatais. A faixa de pH ótimo foi entre 5,0 e 5,5
para xilanases e 5,0 para CMCase, enquanto a temperatura ótima foi 60°C, para ambas as atividades enzimáticas.
A atividade de FPase apresentou melhor resultado em pH 5,0 no cultivo de A. oryzae crescido em engaço de bananeira, porém, a amplitude de faixa de pH para essas enzimas foi estendida entre 3,5 e 8,0, nos três tampões testados, chegando a mais de 70% da atividade máxima observada. O cultivo de A. terreus em engaço foi o que apresentou o segundo melhor resultado junto aos demais cultivos, principalmente entre a faixa tamponante ácida até a neutra entre 5,0 e 7,5 para os tampões acetato de sódio e Tris-HCl (Figura 5). Porém, esse cultivo de A.
terreus crescido em engaço de bananeira atingiu em torno de 55% da atividade máxima de FPase
nos pHs 6,0 e 7,0, quando comparado com o cultivo de A. oryzae em engaço de bananeira (Figura 5).
A avicelase produzida por estes fungos apresentou melhores resultados de atividade enzimática na faixa de pH neutro, principalmente no tampão fosfato de sódio. Para as avicelases, o melhor resultado obtido foi no cultivo de A. oryzae crescido em bagaço nos pHs 6,0 e 6,5 (Figura 6). O cultivo de A. oryzae crescido em engaço de bananeira também mostrou melhores resultados nos demais cultivos na faixa ácida, principalmente no pH 5,0, juntamente com os cultivos deste mesmo fungo nos substratos bagaço de cana-de-açúcar e piolho-de-algodão-sujo, com atividades em torno de 65% da atividade máxima de avicelases observada no cultivo de A.
oryzae crescido em bagaço. Os demais cultivos apresentaram atividades de avicelases abaixo de
60%, em todas as faixas tamponantes testadas (Figura 6).
As celulases no cultivo SmF (Figura 3) e no SSF (Figura 5) apresentaram atividades relevantes, tanto na faixa ácida como na neutra, para alguns tratamentos. De acordo com Baig et
al. (2004), o pH 6,0 favoreceu o processo de sacarificação de pseudocales de bananeira, quando
foram utilizadas enzimas celulolíticas de Trichoderma lignorum. Os mesmos autores citam, em trabalhos anteriores, pH 6,0 como ideal para a sacarificação de outros resíduos agrícolas lignocelulolíticos. Estes dados de pH e temperatura ótimas da sacarificação dos pseudocaules de bananeira estão de acordo com os valores encontrados neste trabalho.