Three phases of data collection

CARRAGENINA

Para a avaliação da atividade antiinflamatória dos extratos de Lychnophoras foi utilizado o modelo de inflamação descrito por WINTER et al. (1962) com modificações. Um volume de 0,02 ml de carragenina 0,1% em solução foi injetado na região subplantar da pata direita posterior dos camundongos. A pata esquerda posterior foi submetida apenas à introdução da agulha (sham). As pomadas dos extratos de Lychnophoras nas concentrações 5 e 10% ou a pomada base foram administradas com auxílio de uma espátula logo após a injeção de carragenina ou apenas introdução da agulha na pata do animal. O grupo padrão recebeu diclofenaco gel após administração de carragenina na pata direita. Para permitir a permanência da pomada em contato com a pata do animal até o fim do experimento, foi utilizado gaze e esparadrapo, assegurando assim a absorção local da pomada. Os animais foram, então, colocados em gaiolas individuais e 3 h (horas) após a administração da carragenina as espessuras das patas foram novamente mensuradas. O edema de pata foi expresso em milímetros (mm) e calculado como a variação (∆) entre o tempo zero e 3 h após a administração de carragenina, momento em que ocorre pico de formação do edema (CARVALHO et al., 1999).

5.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Com o objetivo de validar a mensuração do edema de pata, no presente estudo, as espessuras das patas dos camundongos mensuradas com o uso do paquímetro foi comparada às mensurações utilizando-se o pletismômetro. Os dados foram expressos como variação percentual da espessura (Figura 8 e Tabela 2) e volume (Figura 9 e

Tabela 3) da pata 1 e 3 h após administração da carragenina em relação ao tempo zero (antes da administração da carragenina).

A Figura 8 mostra que o aumento da espessura das patas dos animais foi significativa 1 e 3 h após administração de carragenina 0,1 e 1%, comparado ao grupo controle. Entretanto, carragenina 1% foi mais efetiva em produzir o edema de pata em camundongos nos dois tempos analisados. Esses achados estão em acordo com os resultados obtidos com as medidas com o pletismômetro para as patas que receberam carragenina 1% (Figura 9). Entretanto, na mensuração com pletismômetro o aumento do volume das patas que receberam carragenina 0,1% na primeira hora foi maior que na terceira hora. Isto não era esperado, já que se sabe que o edema atinge seu maior volume 3 h após a administração de carragenina (CARVALHO et al., 1999) como foi demonstrado por CALVO (2006) usando o pletismômetro. Os resultados sugerem que o paquímetro é tão efetivo quanto o pletismômetro para mensuração do edema de pata induzido pela carragenina 1% em camundongos e se mostrou mais sensível na mensuração do edema de pata induzida por carragenina 0,1% na terceira hora de experimento.

A Figura 10 e a Tabela 4 mostram os resultados obtidos pelo método de edema de pata induzido pela carragenina. A administração tópica das pomadas de L. pinaster e L. trichocarpha em ambas concentrações avaliadas (5 e 10%) e L. passerina e L. candelabrum 10% reduziram significantemente o edema de pata mensurado 3 h após a administração de carragenina, comparado aos grupos controle, sugerindo uma atividade antiinflamatória desses extratos. Somente as pomadas de L. pinaster e L. trichocarpha, em ambas concentrações avaliadas, mostraram atividade antiinflamatória similar ao diclofenaco gel e as demais pomadas de Lychnophoras que apresentaram atividade foram menos ativas que a droga padrão. O método usado para avaliar a atividade antiinflamatória induzida pela carragenina 0,1% em camundongos foi satisfatório, visto que foi observada uma diferença significativa entre as patas sham e controle que receberam injeção de carragenina 0,1% e foram tratadas com pomada base

contendo extratos das espécies de Lychnophora também desenvolveram algum edema, porém de maneira similar ao desenvolvido no grupo sham tratado com pomada base, sem alterações induzidas pelo tratamento com os extratos. Tais observações indicam ausência de atividade pró-inflamatória dos extratos de Lychnophoras por via tópica e, avaliando a metodologia utilizada, foi observado que apenas a inserção da agulha na pata induz a um discreto processo inflamatório agudo.

Os resultados obtidos estão em acordo com AZEVEDO (2004) que demonstrou a atividade antiedematogênica da solução hidroalcoólica do extrato de L. pinaster administrada por via oral em camundongos.

Considerando que as espécies de Lychnophora são usadas em infusões, banhos ou macerados em etanol ou cachaça por via tópica como analgésico e antiinflamatório, o presente trabalho é relevante já que demonstra pela primeira vez a atividade antiinflamatória in vivo, mais especificamente atividade antiedematogênica, da administração tópica dos extratos das espécies de Lychnophora e indica quais espécies devem ser usadas para essa atividade.

O edema de pata induzido pela carragenina é um modelo experimental de inflamação aguda que envolve diferentes fases (VINEGAR et al., 1969). Primeiramente a carragenina estimula a liberação de citocinas pró-inflamatórias que estimulam a liberação de serotonina e histamina nos primeiros 90 min, e de cininas numa fase intermediária (90-150 min) (RONALD & CHRISTOPHER, 1990; FERREIRA et al., 1993). A partir deste momento o edema é mantido principalmente pela produção de PGs (DI ROSA & SORRENTINO, 1968; DI ROSA et al., 1971; DI ROSA, 1972; DI ROSA & WILLOGHBY, 1971). Outros mediadores tal como os produtos do sistema de complemento (WILLOUGHBY et al., 1969), a somatostatina (TRAUB & BROZOSKI, 1996) e SP (GILLIGAM et al., 1994) também estão envolvidos na resposta inflamatória induzida pela carragenina. O NO outro importante mediador exerce um papel chave no desenvolvimento do edema e da nocicepção induzida pela carragenina (SALVEMINI et al., 1996). Em camundongos, pode ser observada uma resposta inflamatória de 24-72 h após a injeção de carragenina, evidenciada pelo acúmulo de macrófagos, eosinófilos e linfócitos e cuja mediação depende principalmente de citocinas (HENRIQUES et al., 1987). O edema inflamatório decorre da interação entre substâncias que promovem o aumento da permeabilidade vascular, com mediadores que causam vasodilatação.

Embora os vasodilatores sejam incapazes de induzir o edema, eles potenciam a atuação dos outros mediadores, por aumentarem o aporte sangüíneo na região inflamada (WILLIAMS, 1978; 1979). Desta forma, AINEs como o diclofenaco, usado como droga padrão no método de edema de pata no presente estudo, que inibem a ação da ciclooxigenase (COX) e conseqüentemente reduzem a produção de PGs, retiram a potenciação exercida pelo efeito vasodilatador destes mediadores lipídicos reduzindo assim, o edema inflamatório (TULUNAY, 2000).

O mecanismo pelo qual os extratos de Lychnophoras produzem atividade antiinflamatória e os metabólitos responsáveis por tal atividade ainda não está claro. Já foi demonstrado por KIMURA et al. (1985) que ácidos cafeoilquínicos reduzem a liberação de histamina por mastócitos in vitro. Ácidos cafeicos já foram isolados de L. ericoides (SANTOS et al., 2005) e L. pinaster (SILVEIRA et al., 2005b). A atividade antiinflamatória da cubebina, lignana já isolada de L. ericoides (BORSATO et al., 2000) já foi demonstrada no método de edema de pata induzido pela carragenina (BASTOS et al., 2001).

A atividade antiinflamatória de muitas plantas foi atribuída aos seus constituintes flavonóides (PARMAR & GOSH, 1978) e triterpenos (AHMAD et al., 1983), os quais já foram isolados de muitas espécies de Lychnophora. Em um sítio de inflamação há uma grande concentração de radicais livres e oxidantes, os quais desempenham um importante papel em diferentes processos da inflamação. Diante disso, compostos antioxidantes como os flavonóides isolados de L. passerina (CHICARO et al., 2004) e de L. ericoides (KANASHIRO et al., 2004) podem evitar esses processos (SALVEMINI et al., 1996). CALIXTO et al. (2000) revelaram a atividade analgésica e/ou antiinflamatória de vários flavonóides e essas atividades foram associadas a vários fatores. Estudos demonstraram que a quercetina, flavonóide já isolado das espécies L. passerina (CHICARO et al., 2004), L. ericoides (BORELLA et al., 1998) e L. pinaster (SILVEIRA et al., 2005b), inibe a produção de NO e a expressão de iNOS (óxido nítrico sintase induzível) in vitro (MARTÍNEZ-FLÓREZ et al., 2005),

bloqueio da ativação de NF- B e conseqüentemente a inibição da expressão de genes pró-inflamatórios. Kaempferol também exibiu efeito inibitório da enzima xantina oxidase (ZHANG et al., 2006). Além da quercetina e do kaempferol, os flavonóides apigenina, luteolina e tirilosídeo também já foram isolados da espécie L. passerina (CHICARO et al., 2004). Em estudos in vitro a quercetina e o tirilosídeo inibiram significativamente a produção de NO e das citocinas TNF- e IL-12 (RAO et al., 2005). Estudos feitos com apigenina in vitro demonstraram que esse flavonóide tem efeito inibitório sobre a expressão gênica de TNF- (KOWALSKY et al., 2005), inibe a produção de NO (SOLIMAN et al., 1998) e ainda, tal como a luteolina, apresenta atividade inibitória das enzimas COX-2 e 5-LOX (KIM et al., 2006). A luteolina também inibiu TNF- em estudos realizados in vivo e in vitro (UEDA et al., 2002) e recentemente inibiu eficientemente o edema de pata induzido pela carragenina e essa atividade foi atribuída à sua ação inibitória sobre a expressão gênica da enzima COX-2 (ZIYAN et al., 2007).

A atividade antiinflamatória também é uma atividade comum de muitos triterpenos (SAFAIHY & SAILER, 1997) e vários mecanismos foram atribuídos a essa atividade incluindo: inibição da atividade da COX, LOX e elastase e do sistema de complemento (SINGH et al., 1992). A atividade antioxidante de vários triterpenos incluindo alguns presentes nas Lychnophoras já foi demonstrada (ANDRIKOPOULOS et al., 2003).

Recentemente, FERRAZ FILHA et al. (2006) revelaram que as espécies L. passerina, L. candelabrum, L. pinaster, L. ericoides, L. staavioides e L. trichocarpha possuem uma alta atividade inibitória da enzima xantina oxidase, a enzima que catalisa o metabolismo de xantina e hipoxantina em ácido úrico, o qual é responsável pela doença chamada gota causada pela deposição de ácido úrico nas articulações (CHIANG et al., 1994). Além disso, a xantina oxidase é uma importante fonte de radicais livres derivados do oxigênio que contribuem para os danos oxidativos dos tecidos envolvidos em muitos processos patológicos como, por exemplo, a inflamação. Diante disso, por inibir a xantina oxidase, as espécies de Lychnophora são úteis no tratamento da gota e outras doenças induzidas pela atividade dessa enzima, justificando assim o uso popular dessas espécies no tratamento do reumatismo (SWEENEY et al., 2001). Além disso, as lactonas sesquiterpênicas parecem modular muitos processos que influenciam reações

inflamatórias, por exemplo, fosforilação oxidativa, agregação plaquetária, liberação de histamina e serotonina (HALL et al., 1980; SCHRÖDER et al., 1990). Essas atividades são mediadas quimicamente por estruturas carbonílicas , -insaturadas, que reagem com nucleófilos, especialmente grupos cisteína sulfidrílicos (SCHMIDT, 1999; PICMAN et al., 1979; PICMAN, 1986). Centraterina, 15-deoxigoiazensolídeo e licnofolídeo, lactonas sesquiterpênicas isoladas de L. ericoides, apresentam um grupo - metileno- -lactona e um grupo carbonil , , , -insaturado (SAKAMOTO et al., 2003). Além desses grupos, centraterina e goiazensolídeo também apresentam um grupo acil , , , -insaturado que é considerado o terceiro sítio de reação. Esses dois compostos são os mais potentes membros antiinflamatórios dos furanoheliangolídeos como demonstrado in vitro (RÜNGELER et al., 1999). A atividade antiinflamatória das lactonas sesquiterpênicas é principalmente atribuída à inibição do fator transcricional NF- B (LYß et al., 1997), um dos reguladores chave dos genes envolvidos na resposta imune e inflamatória, pela alquilação seletiva de sua subunidade p65, provavelmente através da reação com resíduos de cisteína (RÜNGELER et al., 1999; LYß et al., 1998). Embora as lactonas sesquiterpênicas sejam conhecidas por suas atividades antiinflamatórias in vitro, ainda não há nenhuma evidência dessas atividades in vivo.

Embora a espécie L. ericoides contenha lactonas sesquiterpênicas que apresentam atividade antiinflamatória in vitro (RÜNGELER et al., 1999), essa espécie não mostrou atividade no método de edema de pata induzido pela carragenina no presente trabalho.

O presente trabalho demonstrou pela primeira vez que uma simples formula contendo extrato etanólico de algumas espécies de Lychnophora nativas do Brasil pode realmente produzir um efeito antiinflamatório. Entretanto, os resultados do método de edema de pata mostram que nem todas as espécies apresentam tal atividade, como também foi observado nos testes de antinocicepção. Salienta-se assim mais uma vez a importância da correta identificação e conhecimento das propriedades farmacológicas das espécies de Lychnophora para o uso racional das mesmas.

-10 0 10 20 30 40 50 1 3 Tempo após administração de

carragenina (h) V a ri a ç ã o d a E s p e s s u ra ( % ) Controle Sham Carragenina 0,1% Carragenina 1%

Figura 8: Variação percentual da espessura da pata mensurada pelo paquímetro em camundongos. Os valores representam a média + e.p.m. *P 0,05 comparado ao grupo controle (ANOVA seguido de teste Dunnett).

-10 0 10 20 30 40 50 1 3 Tempo após administração de

carragenina (h) V a ri a ç ã o d o v o lu m e ( % ) Controle Sham Carragenina 0,1% Carragenina 1%

Figura 9: Variação percentual do volume da pata mensurada pelo pletismômetro em camundongos. Os valores representam a média + e.p.m. *P 0,05 comparado ao grupo controle (ANOVA seguido de teste Dunnett).

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Tabela 2: Variação percentual da espessura das patas dos animais Variação da espessura (%) Tratamento 1 h 3 h Controle 4 ± 1,2 6 ± 1,4 Sham -0,0 ± 1,3 4 ± 1,5 Carragenina 0,1% 27 ± 2,5* 32 ± 2,0* Carragenina 1 % 41 ± 3,6* 43 ± 2,7*

Os valores representam a média + e.p.m.

*P 0,05 comparado ao grupo controle (ANOVA seguido de teste Dunnett)

Tabela 3: Variação percentual do volume das patas dos animais Variação do volume (%) Tratamento 1 h 3 h Controle -5 ± 3,3 -5 ± 4,2 Sham -2 ± 1,6 -6 ± 1,9 Carragenina 0,1% 38 ± 6,3* 31 ± 7,0* Carragenina 1 % 41 ± 4,9* 44 ± 3,3*

Os valores representam a média + e.p.m.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 V a ri a ç ã o d a e s p e s s u ra d a s p a ta s ( 1 0 -2 m m ) Pomada Base Sham Diclofenaco L. passerina 5% L. passerina 10% L. candelabrum 5% L. candelabrum 10% L. pinaster 5% L. pinaster 10% L. ericoides 5% L. ericoides 10% L. staavioides 5% L. staavioides 10% L. trichocarpha 5% L. trichocarpha 10%

Figura 10: Efeito dos extratos etanólicos de Lychnophoras na variação da espessura das patas mensuradas antes e 3 após administração de carragenina 0,1% em camundongos. Os valores representam a média + e.p.m. *P 0,05 comparado ao grupo controle (ANOVA seguido de teste Dunnett).

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Tabela 4: Variação da espessura das patas dos animais após injeção de carragenina ou introdução da agulha na pata (sham) e tratamento tópico

Variação da espessura das patas (x 10-2 mm) Tratamento tópico Após injeção sham Após injeção de carragenina Pomada base 2,6 ± 0,44 5,9 ± 0,45** L. passerina 5% 1,5 ± 0,37 4,8 ± 0,47 L. passerina 10% 2,6 ± 0,90 3,7 ± 0,57* L. candelabrum 5% 1,6 ± 0,72 4,9 ± 1,01 L. candelabrum 10% 1,4 ± 0,44 3,9 ± 0,38* L. pinaster 5% 0,3 ± 0,17 2,3 ± 0,60* L. pinaster 10% 1,6 ± 0,64 3,4 ± 0,83* L. ericoides 5% 2,3 ± 1,76 4,6 ± 1,18 L. ericoides 10% 0,5 ± 0,13 6,1 ± 1,23 L. staavioides 5% 0,8 ± 0,25 6,3 ± 1,29 L. staavioides 10% 1,0 ± 0,29 5,6 ± 0,74 L. trichocarpha 5% 0,8 ± 0,38 2,9 ± 0,43* L. trichocarpha 10% 0,4 ± 0,15 3,7 ± 0,49*

Os valores representam a média + e.p.m.

**P 0,05 comparado ao grupo sham tratado com pomada base

*P 0,05 comparado ao grupo controle tratado com carragenina e pomada base (ANOVA seguido de teste Dunnett).

6. AVALIAÇÃO DA