PESTEL

O tratamento de doenças infecciosas causadas por bactérias ou fungos também persiste como um desafio para a saúde pública (WOODFORD & LIVERMORE, 2009; PELEG et al., 2010; ENOCH et al., 2006). Apesar de existirem inúmeros antibióticos e quimioterápicos disponíveis para uso clínico, a resistência dos microorganismos frente aos antibióticos nas últimas décadas reforça a necessidade substancial por novas classes de agentes antimicrobianos que possuam novos mecanismos de ação ou que sejam mais seguros e efetivos do que aqueles já disponíveis (THOMAS et al., 2010). Dentre as diversas moléculas planejadas com este propósito, os N-heterociclos têm recebido atenção considerável devido à sua importância biológica.

Em uma triagem inicial, os compostos 23a-i, 24f, 25f, 26, 27, 28f, 29f e 30 (Figura 26, pág. 26 e 27) foram selecionados para serem submetidos a testes de atividade antimicrobiana e antifúngica, como será descrito adiante. Estes testes foram realizados no Laboratório de Microbiologia Aplicada, no Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, pela doutora Fernanda Fraga Campos, sob a coordenação da Professora Dra. Vera Lúcia dos Santos.

Ensaio

Linhagens celulares

Os seguintes micro-organismos da American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA) foram escolhidos para se fazer o teste antimicrobiano: bactérias Gram-positivas (Staphylococcus aureus ATCC 25295 e Listeria monocytogenes ATCC 19115), bactérias Gram- negativas (Escherichia coli ATCC 18804 e Klebsiella oxytoca ATCC 49131), fungos filamentosos (Aspergillus niger ATCC 1015 e A. fumigatus ATCC 16913) e leveduras (Candida

Cultura celular

As bactérias foram mantidas no ágar Brain Heart Infusion (BHI, Difco, USA), enquanto os fungos foram mantidos em ágar Sabouraud- dextrose (Oxoid, Basingstoke, UK). O meio de cultura Mueller Hinton (Himedia, India) foi preparado de acordo com o documento M7-A6 do CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) para ensaio bacteriano de Concentração Inibitória Mínima (CIM). O inóculo de todas as bactérias foi realizado usando-se o método espectrofotométrico, com concentração final de 5 x 105 UFC/mL. As culturas de Aspergillus e

Candida foram repicadas e mantidas em ágar Sabouraud-dextrose 24 horas antes da realização

do ensaio e foram deixados em estufa a 35 °C. As suspensões dos inóculos de Aspergillus foram preparadas pelo método espectrofotométrico de acordo com o documento M38-A do CLSI, com concentrações finais de 0,4 a 5,0 x 104 células/mL para os testes de susceptibilidade. As suspensões de inóculo de Candida foram preparadas usando o método espectrofotométrico de acordo com o documento M27-A2 do CLSI, com concentrações finais de 1,5 ± 1,0 x 103 células/mL para o teste de susceptibilidade. Após homogeneização em vórtex, a transmitância foi medida a 520 nm e ajustada entre 69% e 70%.

Ensaio antimicrobiano

A susceptibilidade das cepas frente aos compostos 23a-i, 24f, 25f, 26, 27, 28f, 29f e 30 foi determinada pelo método de microdiluição em caldo, que foi realizado de acordo com as diretrizes dos documentos do CLSI: M7-A6 para as bactérias, M38-A para os fungos filamentosos e M27-A2 para as leveduras. Os compostos foram dissolvidos em DMSO após adição do caldo Mueller Hinton para ensaios antibacterianos ou RPMI para ensaios antifúngicos. Uma série de diluições sequenciais dos compostos foi realizada utilizando-se o meio de cultura respectivo como solvente e mantendo-se um volume constante de 1 mL em cada tubo. Desta maneira, os compostos foram testados a oito concentrações diferentes, que variaram de 1,5 a 200 µg/mL. Para cada diluição, alíquotas de 0,1 mL foram distribuídas nas cavidades de microplacas de 96 poços (Difco, Detroit, MI, USA). Para o controle de esterilidade, o meio de cultura foi utilizado sem adição de amostra e inóculo. Para o controle de crescimento (branco), o meio de cultura foi utilizado sem adição de amostra. Como controle de toxicidade do solvente, um inóculo da cultura com DMSO na maior concentração utilizada foi testado. O cloranfenicol (Sigma-Aldrich, 0,78 a 100 µg/mL) foi usado como controle positivo antibacteriano, e a

anfotericina B (Sigma-Aldrich, 0,03 a 25 µg/mL) foi usada como controle positivo antifúngico. Após a distribuição dos meios de cultura contendo as amostras nas placas de 96 poços e a adição dos inóculos de fungos ou bactérias, as placas foram incubadas a 37 C por 24 h (bactérias), 48 h (Candida) ou 72 h (Aspergillus). Todos os testes foram realizados em duplicata. A leitura dos resultados foi realizada visualmente. Os valores de Concentração Inibitória Mínima (CIM), definida como a menor concentração da amostra capaz de tornar o poço transparente (onde não se via o crescimento de células ou a turvação do meio de cultura), foi expresso em µg/mL. Resultados

Os resultados do teste antimicrobiano foram expressos pela CIM (µg/mL), e estão apresentados na Tabela 4 (pág. 45). Quanto menor o valor da CIM, maior a atividade antibacteriana ou antifúngica. De acordo com os resultados apresentados nesta tabela, verifica-se que alguns compostos apresentaram atividade antibacteriana moderada, mas em geral a atividade antifúngica foi pequena. Nenhum dos compostos apresentou atividade similar ou foi mais ativo do que os fármacos usados como referência (cloranfenicol ou anfotericina B). Os compostos mais ativos contra a bactéria S. aureus foram 26 e 29f, que apresentaram um valor de CIM = 50 µg/mL, metade do valor obtido para o cloranfenicol (CIM = 25 µg/mL). O composto 27 foi o único que foi ativo frente a três bactécrias: E. coli (CIM = 50 µg/mL), L. monocytogenes (CIM = 50 µg/mL) e K. oxytoca (CIM = 50 µg/mL), também apresentando um valor de CIM igual à metade do valor encontrado para o cloranfenicol (CIM = 25 µg/mL frente a todas as bactérias testadas). O composto 23a também apresentou metade da atividade do controle positivo contra a bactéria L. monocytogenes (CIM = 50 µg/mL).

Enquanto os compostos derivados da 8-hidroxiquinolina 23b, 23c, 23d, 23e, 23f e 23h apresentaram exclusivamente atividade antifúngica, os compostos derivados esterificados 25f, 27, 28f, 29f e o derivado glicosídico 30 foram seletivos contra as bactérias. De posse dos resultados deste teste biolólógico, não se pode estabelecer uma relação entre os núcleos quinolínico ou nicotínico e seus substituintes com a atividade antimicrobiana dos triazóis testados.

Tabela 4 - Atividade antimicrobiana (µg/mL) dos compostos 23a-i, 24f, 25f, 26, 27, 28f, 29f e 30

Composto

Micro-organismos

S.A1 E.C2 L.M3 K.O4 A.N5 A.F6 C.A7 C.T8

23a - - 50 100 100 50 - 100 23b - - - 100 100 23c - - - 100 100 - 23d - - - 50 - - 23e - - - - 100 - - - 23f - - - - 100 - - - 23g - - - - 23h - - - - 100 50 - 100 23i 100 - - 100 - - 50 50 26f - 100 - 100 - - 100 - 25f 100 - 100 - - - - - 26 50 - - 100 - - 50 50 27 - 50 50 50 - - - - 28f - - - 100 - - - - 29f 50 - - 100 - - - - 30 100 100 - - - - Clor. 25 25 25 25 - - - - Anf. B - - - - 1,5 1,5 0,25 0,12 1

S.A: Staphylococcus aureus; 2 E.C: Escherichia coli; 3 L.M: Listeria monocytogenes; 4K.O: Klebsiella oxytoca; 5 A.N: Aspergillus niger; 6 A.F: Aspergillus fumigatus; 7 C.A: Candida albicans; 8 C.T: Candida tropicalis. Clor.: cloranfenicol. Anf. B: anfotericina B. Os valores de CIM foram avaliados numa faixa de concentração entre 1,5 e 200 µg/mL. (-): inativo.