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A Figura 62A mostra a distribuição das moléculas de FAT adsorvidas em camadas de filmes LB a partir de uma solução 0,35g/ml (o que proporciona uma densidade de 375ng/cm2). A escala do eizo z, perpendicular ao plano da figura, é mostrada ao lado e distingüida pela escala de cores. Dessa forma, as regiões escuras correspondem a depressões que atribuímos a áreas não recobertas pela enzima. A adsorção da forma FAT a partir de uma solução 0,55g/ml resultou em uma cobertura correspondente à formação de uma monocamada da enzima (540ng/cm2), de acordo com a isoterma de adsorção apresentada na Figura 14. Na imagem B(I), observam-se domínios com maior altura que o padrão geral da camada de proteína que praticamente cobre toda a matriz fosfolipídica. Esses domínios correspondem ou à formação de uma bicamada de FAT, ou à alteração da orientação da cadeia polipeptídica. Além disso, a atividade enzimática correspondente a 8,4% em relação ao meio homogêneo (veja Tabela 6) é baixa, como já discutido, devido ao maior empacotamento superficial enzimática no filme, o que proporciona uma menor mobilidade da cadeia polipeptídica e/ou restrições de acesso ao sítio catalítico pelo substrato.

A adsorção de uma monocamada mista de DMPA/FAT resulta em uma monocamada com uma densidade superficial máxima sempre que a quantidade de proteína na cuba for suficiente para cobrir a matriz fosfolipídica (imagens C da Figura 62), resultando em uma atividade enzimática de 10% em relação ao meio homogêneo. Esse resultado pode ser atribuído à agregação da proteína na interface ar/água. As micrografias desses filmes mostram que, apesar da densidade superficial máxima de 540ng/cm2 ter sido

atingida, há uma distribuição menos homogênea que aquela observada nas imagens para a proteína adsorvida a partir de solução (sistema de recobrimento por imersão). A inserção da âncora hidrofóbica, portanto, dirige a adsorção e promove a orientação da forma FAT. Entretanto, deve ser ressaltado que a orientação perpendicular (em relação a plano da matriz lipídica) do eixo maior do elipsóide da forma FAT é pouco provável devido à ação de uma (ou duas) âncora(s) por molécula de proteína na adsorção. Os valores de rugosidade obtidos confirmam esse resultado, uma vez uma rugosidade máxima de 59Å é obtida, e a orientação perpendicular resultaria em uma rugosidade ao menos duas vezes maior (o eixo maior do elipsóide mede em torno de 100Å)

A Figura 63 mostra a morfologia de filmes DMPA/FAC com a enzima adsorvida de sua solução, o que proporciona uma densidade superficial enzimática de 967ng/cm2 e uma atividade catalítica de somente 2,7% em relação ao meio homogêneo. Filmes LB de DMPA/FAC a partir da monocamada mista não puderam ser preparados devido à alta solubilidade da enzima e ao alto volume da cuba empregada (aproximadamente 650ml). A caracterização por microscopia de força atômica mostra claramente dois diferentes padrões de morfologia, o que indica dois possíveis arranjos para a FAC: com o eixo principal do elipsóide (cadeia polipeptídica) paralelo ou perpendicular à matriz fosfolipídica. Essa interpretação pode ser corroborada pelo fato que, a partir da Figura 63, na imagem que foi obtida por contraste de fase, alguns agregados apresentam fase interna e externa semelhantes (indicado pelas setas na Figura). A densidade máxima atingida para a forma FAC é 1541ng/cm2 com atividade enzimática de 1,7% em relação ao homogêneo. Pelas micrografias, pode-se concluir que a monocamada de FAC adsorvida sobre o filme LB de DMPA tem uma espessura que é aproximadamente o dobro daquela obtida para a adsorção da forma FAT (ver Tabela 6). Tomemos como base a densidade máxima para cada forma

de proteína, que corresponde à formação de uma monocamada protéica completa sobre a matriz lipídica. Para FAT, a rugosidade média é de 42 ou 38Å (dependendo do método de imobilização), enquanto para FAC esse valor é 78Å. A rugosidade máxima para forma FAT é de 59 ou 51Å2, enquanto para a forma FAC, esse valor é de 109Å. Esses valores são compatíveis com as dimensões da proteína: um elipsóide com eixo maior de 100Å e menor de 50Å.

Medidas de elipsometria também mostraram que os filmes de FAC imobilizados sobre a matriz de DMPA têm espessura aproximadamente duas vezes maior que filmes de FAT (Tabela 6)

Portanto, a densidade máxima atingida para a FAC, sua baixa atividade enzimática, a comparação da rugosidade dos filmes das duas formas de enzima, e o fato que a espessura da forma FAC ser o dobro da espessura da forma FAT demanda um modelo que diferencie a orientação das duas formas de enzima quando imobilizadas aos filmes lipídicos suportados em substratos sólidos.

A(I) A(II)

B(I) B(II)

C(I) C(II)

Figura 62: Micrografias para filmes mistos FAT/DMPA, (I) modo altura, (II) modo fase.

(A) FAT imobilizada a partir de solução num filme LB de pré-formado com 3 camadas de DMPA, densidade protéica final 375ng/cm2

(B) FAT imobilizada a partir de solução num filme LB de pré-formado com 3 camadas de DMPA, densidade protéica final: 540ng/cm2

(C) FAT imobilizada pelo método LB a partir de uma monocamada mista de

DMPA/FAT (3,5 g/L)sobre um filme LB pré-formado com três camadas de DMPA, densidade protéica final: 540ng/cm2.

Figura 63: Micrografias de força atômica de filmes LB mistos de FAC (975ng/cm2)/DMPA. A enzima foi depositada a partir de uma solução (0,15g/l) em um filme LB pré-formado com 4 camadas de DMPA. Direita: modo altura, esquerda: modo fase.

Tabela 6: Propriedades das formas FAT e FAC imobilizadas em filmes LB de DMPA . A densidade superficial foi determinada por microbalança a cristal de quartzo (MCQ). As rugosidades, por microscopia de força atômica (MFA) – modo contato intermitente. E, a espessura média (obtida em triplicata), por elipsometria, a um ângulo de incidência de 70o _{e considerando um índice de refração}

igual a 1,50.

Forma da

enzima Método de imobilização Densidade superficial (ng/cm2₎

Rugosidade média (Å)

Rugosidade

máxima (Å) Espessura média Atividade enzimática (%)* FAT Recobrimento por imersão 375 25 33 - 12.0 540 42 59 363 8.4 Monocamada mista 540 38 51 - 10.0 FAC Recobrimento por imersão 975 73 95 - 2.7 1540 78 109 755 1.7

9.4. Modelo proposto para o empacotamento superficial da