Perception of the Subject

A avaliação in vitro dos complexos Tc2-Tc9 compreendeu o estudo da estabilidade in vitro em condições fisiológicas e ainda a determinação da afinidade dos compostos para a melanina. A análise por HPLC demonstrou que os complexos Tc2-Tc9 são estáveis em condições fisiológicas (PBS, pH 7,4; 37 ºC), não sofrendo qualquer tipo de degradação ao fim de 24 h.

A avaliação da afinidade in vitro dos complexos Tc2-Tc9 para o pigmento melanina foi efectuada através do estudo da ligação dos complexos à melanina sintética disponível comercialmente. Na literatura apenas se encontravam descritos estudos semelhantes para moléculas radioiodadas.102,104,107 _{Assim, foi necessário optimizar diferentes parâmetros}

experimentais (tempo de incubação, concentração de melanina, entre outros) no sentido de transpor a metodologia descrita na literatura para os complexos de 99m_Tc.

A capacidade de ligação dos complexos à melanina foi determinada através da co- incubação dos complexos Tc2-Tc9 com uma suspensão de melanina sintética em água destilada, numa concentração de 0,5 mg de melanina por 10 mL de H2O. Os complexos de 99m_{Tc foram previamente purificados por HPLC a fim de remover o ligando livre que}

também apresenta afinidade para a melanina, tendo sido verificado que competia com o complexo na ligação ao pigmento. A ligação dos complexos à melanina apresenta uma cinética muito rápida, observando-se a mesma percentagem de ligação após 1 e 24 h de incubação. Assim, os ensaios in vitro da ligação de Tc2-Tc9 à melanina sintética envolveram a incubação a 37 ºC dos compostos com o pigmento durante 1 h. Ao fim deste tempo e após tratamento adequado, foram retiradas alíquotas do sobrenadante que contém a fracção de complexo que não se liga à melanina. A diferença de actividade entre estas alíquotas e alíquotas de tubos de controlo aos quais foi adicionado cada complexo em estudo, nas mesmas condições experimentais mas sem melanina, permitiu calcular a percentagem que se ligou à melanina, como descrito com mais detalhe na parte experimental. Na tabela 2.7 apresentam-se os valores de percentagem de ligação à melanina determinados para os complexos Tc2-Tc9 e também para os complexos modelo fac-[99m_Tc(CO)

3{3,5-Mepz(CH2)2NH(CH2)2NH2}]+ 51 (6) e fac-[99mTc(CO)3{3,5-

Mepz(CH2)2NHCH2COO}]55 (7) (figura 2.15). O estudo dos complexos modelo permitiu avaliar

o efeito da introdução dos fragmentos procanamida e 2-aminoetildietilamina na afinidade dos complexos funcionalizados para a melanina.

Tabela 2.7. Percentagem de ligação à melanina dos complexos Tc2-Tc9 e dos complexos-modelo 6

e 7, após 1 h de incubação a 37 ºC ([melanina] = 0,5 mg/10 mL)

Complexo % ligação à melanina

Tc2 79 ± 5 Tc3 94 ± 2 Tc4 77 ± 4 Tc5 71 ± 3 Tc6 76 ± 2 Tc7 67 ± 5 Tc8 60 ± 5 Tc9 87 ± 7 6 70 ± 2 7 0

Os complexos Tc2-Tc9 apresentam uma ligação à melanina moderada a elevada, com valores compreendidos entre 60 e 94%. De uma maneira geral, observa-se que os complexos catiónicos apresentam uma percentagem de ligação superior aos complexos congéneres neutros. O complexo modelo catiónico fac-[99m_Tc(CO)

3{3,5-

Mepz(CH2)2NH(CH2)2NH2}]+ (6) apresenta uma elevada ligação à melanina, sendo mesmo

comparável à apresentada pelos complexos Tc6 e Tc7 que resultaram da funcionalização da sua estrutura com os derivados da benzamida através do anel de pirazolo. Pelo contrário, o complexo fac-[99m_Tc(CO)

3{3,5-Mepz(CH2)2NHCH2COO}] (7) não apresentou

qualquer afinidade para a melanina, mas a sua funcionalização com os grupos procanamida e 2-aminoetildietilamina originou complexos (Tc4, Tc5, Tc8 e Tc9) com elevada afinidade para este pigmento. Como referido no capítulo introdutório, a melanina é um polímero amorfo de carga global negativa.70,120 _{Estudos in vitro mostraram que a ligação de}

diferentes substratos à melanina envolve essencialmente forças de natureza electrostática e interacções hidrofóbicas, dependendo do tipo de compostos.70,120 _{A elevada afinidade}

para a melanina encontrada para o composto fac-[99m_Tc(CO)

3{3,5-Mepz(CH2)2NH(CH2)2NH2}]+

(6) é certamente justificado pelo seu carácter catiónico que potencia o estabelecimento de forças electrostáticas, ao contrário do que acontece para fac-[99m_Tc(CO)

3{3,5-

Mepz(CH2)2NHCH2COO}] (7) que tem um carácter neutro.

Como dito anteriormente, a ligação dos derivados de benzamidas à melanina envolve duas componentes principais: forças electrostáticas e interacções hidrofóbicas.70,120 _{De modo a elucidar qual destas componentes seria predominante na}

interacção com a melanina dos complexos de 99m_{Tc descritos neste capítulo foram}

efectuados estudos adicionais que envolveram a incubação de alguns dos complexos com melanina na presença de n-propanol e a avaliação do efeito da lavagem com soluções de força iónica diferente. Os estudos efectuados na presença de n-propanol (33% em solução aquosa) pretendiam elucidar o eventual envolvimento de interacções hidrofóbicas, uma vez que é o tipo de interacções que este álcool estabelece com o pigmento. As experiências que envolveram lavagens com soluções de diferente força iónica (soluções de NaCl de concentrações crescentes: 0,016 M e 2 M), após incubação prévia dos complexos de 99m_{Tc com a melanina, deveriam indicar o envolvimento de forças electrostáticas na}

interacção dos complexos com a melanina. Para realizar estes estudos, escolheram-se apenas os compostos Tc2-Tc5, funcionalizados através da amina central, uma vez que se pretendia avaliar essencialmente a influência da presença dos diferentes farmacóforos (procanamida vs 2-aminoetildietilamina) e da carga dos complexos na interacção com a

melanina. Nestes ensaios, a percentagem de ligação à melanina foi calculada como atrás descrito e os resultados obtidos encontram-se apresentados na tabela 2.8.

Tabela 2.8. Percentagem de ligação à melanina na presença de n-propanol e após lavagem com

soluções com diferentes forças iónicas, durante 1 h a 37 ºC ([melanina] = 0,5 mg/10 mL)

Composto % ligação à melanina H2O n- propanol(33%)/H2O 1ª lavagem NaCl 0,016 M 2ªlavagem NaCl 2 M Tc2 88 ± 6 79 ± 2 79 ± 5 23 ± 3 Tc3 94 ± 2 86 ± 5 76 ± 5 22 ± 2 Tc4 77 ± 4 30 ± 3 62 ± 4 49 ± 2 Tc5 71 ± 3 20 ± 2 60 ± 4 45 ± 5

Na presença de n-propanol, os complexos neutros (Tc4 e Tc5) sofrem um decréscimo pronunciado na sua percentagem de ligação à melanina que passa de valores da ordem dos 70-80% para valores da ordem dos 20-30%. Esta tendência não foi verificada para os complexos catiónicos, Tc2 e Tc3, cuja percentagem de ligação foi pouco afectada pela presença do n-propanol. Comparativamente aos complexos neutros, a percentagem de ligação dos complexos Tc2 e Tc3 foi mais afectada pela lavagem com soluções de NaCl de concentração crescente, diminuindo drasticamente após a lavagem com a solução de força iónica superior. Estes resultados indicam que a interacção com a melanina dos complexos catiónicos, Tc2 e Tc3, parece ser essencialmente de natureza electrostática. Por sua vez, para os complexos neutros Tc4 e Tc5 essa interacção parece ter predominantemente um carácter hidrofóbico.