Past sea spray field measurements

A família Poxviridae é constituída por duas subfamílias e treze gêneros de complexos vírus de DNA que infectam células de vertebrados e invertebrados. A subfamília

Chordopoxvirinae, que consiste em dez gêneros: Avipoxvirus, Capripoxvirus, Cervidpoxvirus. Crocodylidpoxvirus, Leporipoxvirus, Molluscipoxvirus, Orthopoxvirus, Parapoxvirus, Suinopoxvirus e Yatapoxvirus (ICTV, 2013) e a subfamília Entomopoxvirinae que é divida

em três gêneros baseados no inseto hospedeiro em que foram isolados: Alphaentomopoxvirus,

Betaentomopoxvirus e Gammaentomopoxvirus. No entanto, análises completas das sequências

sugerem mudanças na classificação de alguns indivíduos do gênero Betaentomopoxvirus, colocando-os em gêneros separados (MOSS, 2007; DAMON, 2007).

Dentro do gênero Orthopoxvirus encontram-se os vírus Varíola (VARV), Vaccinia (VACV) e Cowpox. O VARV é o agente etiológico da varíola, doença que flagelou a população humana até a sua “erradicação” no final da década de 70, quando foram feitas

grandes campanhas mundiais de vacinação organizadas pela OMS (Organização Mundial de Saúde). O VACV é o agente etiológico da vaccínia bovina e foi o principal vírus utilizado na campanha de vacinação contra o VARV (LEFKOWITZ et al., 2006; WEYER, 2009) O último caso de ocorrência natural de varíola foi reportado no ano de 1977, tendo dois outros casos ligados a laboratório em 1978 (DAMON, 2007). Já no caso dos VACV, surtos zoonóticos da doeça causada por esses vírus foram relatados no Brasil (ABRAHÃO, J. S. et

al., 2009; TRINDADE et al., 2009) e um modelo hipotético para o ciclo de transmissão

desses vírus foi proposto baseado no fato desses estarem circulando entre animais silvestres, peridomesticos e animais domesticados em diversos estados do país (DA FONSECA, F. G. et

al., 2011)

Os vírus Vaccínia (VACV), assim como todos os outros poxvírus, são vírus grandes e complexos, que infectam animais (cerca de 400 x 240 x 200 nm) (PRESCOTT et al., 2002; SMITH, 2007). São vírus cujo genoma é constituído por DNA de fita dupla, linear, cujo tamanho varia de 130.000 pb até mais de 300.000 pb, e que apresentam alças terminais e repetições invertidas (MOSS, 2007). O DNA está associado com proteínas e contido no cerne, uma estrutura central formada como um disco bicôncavo e cercado por uma membrana. Dois corpos elípticos ou laterais ficam entre o cerne e a membrana externa, que é composto por uma membrana coberta por uma série de túbulos (Figura 9) (PRESCOTT et al., 2002 MURPHY, 1999). Os principais componentes dos poxvírus são proteínas, lipídeos e DNA sendo que cada um deles contribui com, respectivamente, 90%, 5% e 3,2% do peso seco. Os componentes lipídicos do VACV são predominantemente colesterol e fosfolipídeos, sendo o carboidrato um componente encontrado nos vírus extracelulares envelopados (EEVs) como parte das glicoproteínas. Também podem ser encontrados vestígios de RNA, porém, seu significado ainda é incerto (MOSS, 2007).

O processo de multiplicação dos poxvírus inicia-se com um contato da partícula viral com a superfície celular, e sua posterior penetração na célula. O cerne viral é liberado no citoplasma e, é transportado por microtúbulos para o interior da célula em regiões próximas ao núcleo. Entre as várias enzimas encontradas no interior da partícula dos poxvírus existe uma RNA-polimerase viral que transcreve cerca da metade do genoma viral em mRNAs precoces. Esses RNAs são transcritos no interior do cerne do vírus e, a seguir, liberados no citoplasma (MURRAY & ROSENTHAL, 2006). Os mRNAs precoces do VACV são detectados dentro de 20 minutos após a infecção e acumulam em níveis máximos em 1-2 horas (MOSS, 2007).

Dos 50 polipeptídeos encontrados no cerne viral, 30 são enzimas, das quais pelo menos metade são diretamente envolvidas na biossíntese de mRNAs precoces. Como as enzimas necessárias são contidas no interior do cerne viral, a transcrição precoce não é afetada por inibidores da síntese protéica (SMITH, 2007).

Os promotores dos genes do VACV são pequenos (~30pb) e ricos em A+T exatamente

como os promotores encontrados nos genes do hospedeiro, no entanto, os promotores virais não são reconhecidos pela RNA polimerase II das células do hospedeiro, assim como a RNA polimerase do VACV não reconhece os promotores das células hospedeiras (SMITH, 2007).

A replicação do DNA viral ocorre no citoplasma (PRESCOTT et al., 2002) em áreas distintas, que aparecem como “fábricas” ou corpúsculos de inclusão em micrografias eletrônicas (KATSAFANAS & MOSS, 2007). Num modelo proposto, a replicação começaria com a introdução de um corte em uma das fitas de DNA perto das alças terminais. O

Figura 9 – Morfologia do Vaccinia virus. (a) Diagrama da estrutura do Vaccinia. (b) Micrografia do vírus mostrando claramente o nucleóide (x200.000). (c) Estrutura superficial do Vaccinia. Uma micrografia eletrônica de varredura de quatro vírus mostrando a matriz espessa de fibras de superfície (x150.000). Fonte: adaptado de PRESCOTT et al., 2002.

desdobramento da alça permite que a DNA polimerase copie a alça e faça a extensão ate o final do molde. Então, as duas fitas separadas e as cópias de DNA recém produzidas se dobram novamente em alças permitindo que a DNA polimerase continue a extensão da cópia de todo o genoma, podendo formar moléculas concateméricas. Em seguida essas moléculas são clivadas por nucleases específicas em monômeros como mostrado na figura 10, que são empacotados em novos vírus (SMITH, 2007). Cabe ressaltar que este modelo ainda não foi demonstrado experimentalmente. Por outro lado, a existência de uma primase viral sugere que outras formas de replicação do DNA devem ser consideradas (DE SILVA et al. 2007).

Figura 10 – Representação esquemática da replicação do DNA do VACV. A molécula de dsDNA linear com alças terminais é clivada perto de uma alça permitindo a extensão até ao final do modelo. Após a renaturação da alça terminal, a extensão continua a produzir o DNA em moléculas concataméricas intermediárias que são clivadas em monômeros com a mesma unidade de comprimento. O DNA recém sintetizado é mostrado em vermelho e o DNA molde em preto. Fonte: adaptado de SMITH, 2007.

Em células sincronicamente infectadas com o VACV, a replicação do DNA começa 1 a 2 horas após a infecção e resulta na geração de 10.000 cópias do genoma por célula, das quais metade é finalmente empacotada dentro de partículas virais (MOSS, 2007). O ciclo reprodutivo completo nos poxvírus leva cerca de 24 horas (Figura 11). (PRESCOTT et al., 2002).

Figura 11 – Ciclo de multiplicação dos poxvírus. Inicia-se com a adsorção viral seguido de fusão à membrana plasmática e liberação do nucleocapsídeo no citoplasma. Ocorre a transcrição de genes precoces que induzem o desnudamento secundário e consequente replicação do DNA. Durante e após a replicação do DNA, ocorre a transcrição dos genes intermediários e tardios. Por fim, ocorre a morfogênese das partículas virais e aquisição de membranas. As partículas recém formadas podem permanecer dentro da célula, aderidas à membrana plasmática ou serem liberadas para o meio extracelular ou permanecem associadas à célula. Fonte: McFADDEN, 2005.

Estudos de como os poxvírus penetram nas células hospedeiras são complicados devido à existência de múltiplas formas infecciosas que podem usar diferentes receptores celulares e proteínas virais. No entanto, o DNA viral isolado é incapaz de causar infecção. Sabe-se que os vírus envelopados extracelulares (EEVs) e os relacionados vírus envelopados associados às células (CEVs) constituem partículas importantes para a difusão célula-célula, sendo que ocorre a formação de caudas de actina para auxiliar os vírus CEVs nesse processo. Já os vírus intracelulares maduros (IMVs) são partículas que são liberadas através do processo de lise celular (MOSS, 2007; SMITH, 2007). Recentemente foi demonstrado que as formas IMVs também podem entrar na célula através de endocitose mediada por receptor ou macropinocitose (MERCER et al. 2010).

Os vírus EEVs e IMVs, ambos formas infecciosas que se desenvolvem no curso de uma infecção, diferem-se somente porque o EEV é uma partícula de IMV envolvida por um envelope lipídico derivado do “trans-Golgi network” (TGN) ou dos endossomos. Esse envelope, adquirido durante a morfogênese e modificado pela inclusão de diversas proteínas virais e celulares, está ausente nas partículas de IMVs (Figura 12).

A entrada dos IMVs na célula hospedeira ocorre por um processo relativamente simples porque são envolvidos por apenas um envelope lipídico. Assim, o cerne viral pode entrar no citosol logo após a fusão da membrana do vírus com a membrana plasmática. Já a entrada dos EEVs exige que um de seus envelopes lipídicos seja retirado por um mecanismo não fusogênico que necessita de moléculas específicas na superfície da célula e do vírus (SMITH, 2007). Esses diferentes processos de infecção celular são ilustrados na figura 13.

Figura 12 – Representação esquemática que ilustra a diferença básica entre o vírus intracelular maduro e o vírus extracelular envelopado. Fonte: adaptado de SMITH, 2007.

O VACV tem a habilidade de interromper a produção de proteínas da célula hospedeira após a infecção (MURRAY & ROSENTHAL, 2006) de tal forma, que os recursos celulares podem ser quase completamente utilizados para a produção de proteínas virais e proteínas recombinantes associadas ao vírus. As enzimas responsáveis pela síntese de mRNAs virais são todas fornecidas pelo próprio vírus, que traz para o citoplasma celular uma RNA polimerase dependente de DNA para a transcrição de genes virais e recombinantes (SMITH, 2007). Dentre as enzimas da maquinaria de transcrição fornecida pelo vírus incluem-se uma enzima capping, uma poli A polimerase, fatores de iniciação e terminação da transcrição precoce (inicial). Os mRNAs são poliadenilados e possuem uma extremidade metilada na região 5’ (SMITH, 2007).

1.6 – MVA (Vírus Vaccinia Ankara Modificado)

O uso bem sucedido do VACV, no programa mundial de erradicação da varíola em conjunto com o desenvolvimento de estratégias de geração eficiente de vírus Vaccinia recombinantes (rVACV) expressando proteínas exógenas, aumentou o potencial do uso de vetores derivados de poxvírus como delivery systems (sistemas de veiculação) em programas de vacinação (RAMIREZ et al., 2000). O vírus MVA é derivado da linhagem de VACV isolado na cidade de Ankara, Turquia. O MVA foi produzido por atenuação desta linhagem de VACV de Ankara através de passagens seriadas em células primárias de embriões de galinha (CEFs), resultando em deleções no genoma da amostra viral, tornando-a pouco virulenta e

Figura 13 – Representação esquemática da entrada das partículas IMV e EEV na célula hospedeira. As partículas de IMV se ligam ao um receptor na superfície celular não identificado e se fundem com a membrana plasmática permitindo a liberação do cerne viral no citoplasma. A partícula EEV liga-se a superfície celular e glicosaminoglicanos medeiam a disruptura não fusogênica da membrana externa do EEV. O IMV interno em seguida liga-se a superfície da célula e entra como uma partícula de IMV. Fonte: adaptado de SMITH, 2007.

capaz de atender à demanda da época que se configurava na produção de uma vacina segura contra a Varíola (RAMIREZ et al., 2000).

Análises do genoma feitas por Meyer et al. (1991) e Antoine et al. (1998), identificaram seis regiões principais de deleções (Figura 14) e os genes oriundos da amostra parental (cerca de 15% do genoma parental viral, 30.000 pb), perdidos durante o curso da atenuação com mais de 570 passagens em cultura de células (ANTOINE et al., 1998). Isso tornou o MVA inapto a multiplicar produtivamente na maioria das células originárias de

mamíferos. No entanto, em CEFs, o MVA consegue multiplicar-se eficientemente

(AUSUBEL et al., 2003). Além disso, de acordo com Garber et al. (2009), rMVA também multiplicam-se em títulos elevados em CEFs.

O defeito replicativo do MVA em células humanas, bem como na maioria das outras células de mamíferos, ocorre no final da morfogênese, mais precisamente como resultado de um bloqueio na maturação do vírus, sem alteração na produção de proteínas precoces e tardias (SUTTER & MOSS, 1992). Apesar dessa incapacidade de multiplicar em muitas células de mamíferos, os MVAs possuem todas as vantagens dos poxvírus para utilização como vetores de expressão em eucariotos, incluindo-se sua enorme capacidade de acomodar DNA exógeno em seu genoma (até 25 Kb) bem como a expressão de altos níveis de proteínas, até mesmo de proteínas recombinantes, capacidade de induzir resposta imune celular e humoral e conferir Figura 14 – Deleções ocorridas no genoma do vírus VACV-ANK que culminaram na formação do vírus MVA. As seis regiões de deleção ocorrem principalmente em regiões pouco conservadas entre os poxvírus e estão relacionadas à redução do espectro de hospedeiros e à evasão do sistema imune. Fonte: adaptado de McFADDEN 2005.

proteção por longos períodos (GEIBEN-LYNN et al., 2008; DREXLER et al., 2004; GRANDPRE et al., 2009).

Vários pesquisadores demonstraram a eficiência do uso de rMVA expressando proteínas virais, tumorais ou de parasitos para indução de imunidade protetora (RAMIREZ et

al., 2000), mesmo que parcial, contra HIV (GUDMUNDSDOTTER et al. 2009; EARL et al.

2009), SIV (OURMANOV et al., 2009), AHSV (CHIAM et al., 2009), Influenza A/H5N1 (KREIJTZ et al., 2009), Dengue (MEN et al., 2000), raiva (ERTL, 2009), malária (HUTCHINGS et al., 2007; PRIEUR et al., 2003), M. tuberculosis (TCHILIAN et al., 2009) e melanoma (GREINER et al., 2006) usando diferentes regimes de imunização com dose e reforço homólogo ou heterólogo e diferentes rotas de administração dos vírus recombinantes.

Apesar dos bons resultados utilizando vírus rMVA para imunização em diferentes protocolos (GRANDPRE et al., 2009), estudos de interações intracelulares do hospedeiro com o vírus rMVA, podem aumentar o sucesso dessa ferramenta molecular em induzir imunidade protetora em mamíferos.