De acordo com Parfitt et. al [10], as medições primárias na histomorfometria óssea podem ser caracterizadas da seguinte forma:
a) medição de área: conforme exposto, as medições de área podem se confundir com as de volume, sendo muitas vezes utilizadas de maneira indiscriminada. Em se tratando da histomorfometria óssea, é bastante comum deparar-se com o termo “void” (lacuna ou vazio), que se aplica a todos os tecidos que não são ósseos, incluindo a medula no osso esponjoso e os canais de Haversian e de Volkmann, no osso cortical. Para esses tecidos, a porosidade é definida como a relação entre volume de espaços vazios e o volume total do tecido (volume de espaços vazios / volume de tecido);
b) medição de distância: em princípio, todas as medições de distância podem ser obtidas de duas formas, ou seja, por medições diretas em múltiplos sítios ou por meio de cálculos indiretos a partir de medições de área e de perímetro. O método direto é usualmente empregado para medições de espessura de parede, distância entre marcadores, tamanhos celulares e nucleares; o método indireto é usado para avaliação da espessura trabecular (no caso do modelo de lâmina), diâmetro trabecular (quando se emprega o modelo de eixo), e separação entre trabéculas. Ambos os métodos são largamente usados para avaliação da espessura cortical e de osteóides.
Na prática, observa-se que os dois indicadores histomorfométricos mais empregados para caracterizar a quantidade de tecido ósseo presente em uma amostra são os seguintes:
a) volume trabecular [BV/TV (%)]: é o volume ocupado pelo osso trabecular, expresso como porcentagem do volume ocupado pela medula e trabéculas ósseas. De maneira prática, o observador ao microscópio obtém esse índice mediante a soma dos pontos do retículo que se sobrepuserem ao osso mineralizado e não-mineralizado, dividido pelo número total de campos ocupados pelo osso trabecular [18];
b) espessura cortical [Ct.Wi (µm)]: é a espessura do osso cortical, expressa em micra, que pode ser referida separadamente à cortical externa ou interna. Para realizar essa medição, emprega-se uma régua micrométrica para avaliar a espessura cortical média, tomando-se a medida de quatro regiões eqüidistantes na extensão de cada cortical. O resultado final é a média das espessuras [18]. Além dos indicadores relacionados à quantidade óssea, há os que servem para avaliar a estrutura trabecular (também conhecidos como indicadores estruturais), e os que tratam da conectividade trabecular (que caracterizam a topologia do osso esponjoso). Os que tratam da estrutura, ou arquitetura trabecular, podem ser discriminados da seguinte maneira [18]:
a) espessura trabecular [Tb.Th (µm)]: é a medida da espessura das trabéculas ósseas expressa em micra. Pode ser calculada empregando-se a seguinte fórmula:
Tb.Th = 2,000/1,199 x B.Ar/B.Pm (o fator 1,199 é usado para corrigir a
obliquidade da seção óssea sob análise microscópica) Onde
B.Ar é a área óssea
B.Pm é o perímetro do segmento histológico ósseo analisado;
b) número trabecular [Tb.N (mm-1)]: é o número de trabéculas ósseas por milímetro linear de tecido. Esse índice expressa a densidade trabecular e pode ser calculado pela seguinte fórmula:
Tb.N = (BV/TV) x 10/Tb.Th
Alguns pesquisadores [45] também utilizam a seguinte expressão para o número trabecular:
Tb.N = T.Ar x 10/Tb.Th, que é expresso em mm
c) separação trabecular [Tb.Sp (µm)]: é a distância entre os pontos médios das trabéculas ósseas, expressa em micra. Pode ser calculada diretamente com retículo micorscópico, ou por meio da seguinte fórmula:
Alguns pesquisadores [18] definem a separação trabecular como sendo a distância entre bordas (em vez da medida realizada entre os pontos médios) e é calculada de acordo com o modelo de lâminas paralelas como Tb.Sp =
1000/Tb.N – Tb.Th, sendo normalmente expresso em µm.
Além dos indicadores estruturais acima discriminados, existem aqueles que são relacionados às características do arranjo espacial do osso esponjoso, ou à conectividade trabecular. A conectividade é uma propriedade tridimensional que descreve a topologia das várias conexões entre os chamados nós (unidades estruturais que representam a confluência de três ou mais trabéculas) e os segmentos de conexão (denominados de “struts” e “termini”).
Os índices de conectividade são característicos do tecido ósseo trabecular, e sua análise é realizada empregando-se métodos semiautomáticos ou automáticos, pelos quais as imagens histológicas são capturadas por um sistema de vídeo e segmentadas para permitir a discriminação dos tecidos. Os índices de conectividade trabecular mais conhecidos são o número de nós (ou nodos, ou “nodes”– Nd) e de terminações (ou “termini” – Tm). Basicamente, constitui-se em contagens expressas por milímetro quadrado de tecido ósseo visualizado, onde o nodo é o ponto de ligação entre duas ou mais trabéculas, e a terminação é o final de uma trabécula que não está conectada com nenhuma outra estrutura. Outra maneira de caracterizar os nodos é sob a forma do encontro de ramais e as terminações como pontos finais no arranjo trabecular. Para realizar essas medições de natureza topológica, emprega-se o recurso de segmentação de imagem denominado de “esqueletização”, mediante o qual define-se um ponto de corte para discriminar os tecidos mineralizados. A razão entre nodos e terminações (Nd/Tm) em uma seção pode ser interpretada como um indicador espacial de conectividade [10]. A Figura 12 (a) mostra a reconstrução tridimensional de uma estrutura trabecular, realizada a partir de imagens tomográficas, e a Figura 12 (b) apresenta a mesma imagem segmentada e esqueletizada, sobre a qual pode-se realizar a quantificação de nós e terminações.
(a) (b)
Figura 12 - (a) Reconstrução tridimensional da estrutura trabecular; (b) respectiva segmentação e esqueletização (b) [46]
A partir dos índices de nós e de terminações, pode-se realizar diferentes combinações, das quais derivam outros indicadores de conectividade, tais como [18]:
a) Terminação-Terminação [Tm.Tm (mm/mm2)]: junção entre duas terminações, ou dois “termini”;
b) Nó-Terminação [Nd.Tm (mm/mm2)]: junção entre um nó e uma terminação, ou “terminus”;
c) Nó-Nó [Nd.Nd (mm/mm2)]: junção estrutural de dois nós;
d) Nó-Laço [Nd.Lp (mm/mm2)]: junção estrutural que forma um laço, ou “loop”;
e) Córtex-Terminação [CtTm (mm/mm2)]: junção estrutural entre uma terminação e o córtex ao qual está conectada;
f) Córtex-Nó [Ct. Nd (mm/mm2)]: junção estrutural entre o córtex e um nó; g) Córtex-Córtex [Ct.Ct (mm/mm2)]: junção estrutural entre o mesmo córtex. Os
índices Nd.Lp e Nd.Nd são diretamente proporcionais à conectividade das trabéculas ósseas, ou seja, quanto maiores esses valores, mais conectada encontra-se a estrutura trabecular a que se referem. Já os índices compostos por terminações (“termini”) são inversamente proporcionais à conectividade, pois expressam pontos que não apresentam conexões estruturais;
h) Volume estrelar [V*m.space (mm3)]: proveniente do inglês “star volume”, é a média da extensão das linhas irradiadas de um ponto aleatório do espaço medular até que intercepte uma trabécula óssea, expresso em milímetro cúbico. Trata-se de uma análise tridimensional, também utilizada para avaliar o grau de conectividade das travessas ósseas;
i) Fator de Forma do Osso Trabecular (“Trabecular Bone Pattern Factor”) [TBPf (mm-1)]: trata-se da análise tridimensional da conectividade que determina a relação das lamelas trabeculares, refletindo a razão da superfície côncava e convexa em seções histológicas bidimensionais. Uma grande quantidade de superfícies côncavas representa uma rede trabecular bem conectada, ao passo que uma grande quantidade de superfícies convexas indica a diminuição da conectividade. Este índice trabecular foi introduzido por Hahn et al. (1992), conforme citado por Klein [34], e parte do princípio de que a estabilidade biomecânica do osso esponjoso é determinada não somente pelo volume ósseo, mas também pela orientação e o grau de interconexão das trabéculas, o que pode ser sumarizado como a microestrutura trabecular. Um valor mais alto de
TBPf implica em um estado pobre de interconexão e vice-versa, um baixo TBPf indica uma estrutura com alto grau de conectividade estrutural [34];
j) Índice de Interconectividade (ICI): é a conectividade das cavidades medulares que podem ser avaliadas depois de realizada a esqueletização. As extremidades terminais e os nós dos ramos da esqueletização são identificados e os ramos mais curtos são eliminados. Então, o número total de nós (N), os ramos nó para nó (NN) e os nós para pontas de ramos livres (NF) são determinados. O número de árvore (T) também é obtido (uma árvore é uma porção independente do espaço medular totalmente fechado por uma estrutura trabecular). O índice de conectividade do osso esponjoso pode ser definido como: ICI = (N x NN) / [T x (NF + 1)]. Quanto maior a interconectividade do osso esponjoso (caracterizada por um elevado número de nós e ramos segmentais e poucas árvores), maiores o índice ICI e a fragmentação do arranjo trabecular [45];
k) Característica de Euler-Poincaré (CEP): é expresso por volume de tecido (CEP/TV) e representa o número de espaços vazios menos o número de componentes conectados. Pode ser interpretado como o máximo número de ramos que podem ser removidos sem quebrar o arranjo em diferentes partes. O número total de perfis trabeculares conectados é indicado por Cυ, enquanto que o número das cavidades medulares (espaços vazios), por Dυ. A Característica de Euler-Poincaré pode, então, ser definida como:
Baixos valores de CEP indicam um osso mais conectado. Valores negativos advêm de estruturas altamente conectadas [45].
Cada um dos indicadores histomorfométricos acima descritos fornece uma informação distinta para fins de análise da microarquitetura trabecular. Essas diferentes informações estabelecidas pelos pesquisadores mostram limitações devido à necessidade de inferir sobre uma estrutura tridimensional a partir de uma informação bidimensional. Todavia, há muitas linhas de evidência confirmando que as medições em seções histológicas bidimensionais são bem correlacionadas com a estrutura tridimensional e, consequentemente, com as propriedades do osso [45].
Dentre os indicadores, ou parâmetros histomorfométricos relacionados à microarquitetura óssea que são mais comumente estudados, pode-se destacar os seguintes:
INDICADORES HISTOMORFOMÉTRICOS ÓSSEOS
Indicador (ou Parâmetro) Abreviação Unidade
Volume ósseo/volume tissular BV/TV %
Número trabecular Tb.N mm-1
Espessura trabecular Tb.Th Mm
Separação trabecular Tb.Sp Mm
Comprimento “esquelético” total TSL Mm
Número de nós/Volume tissular NN/TV N/mm2
Nós/Terminações N/T %
Volume estrelar medular MSV mm3
Fator de forma do osso trabecular TBPf mm-1
Índice de interconectividade ICI
Característica de Euler-Poincaré CEP/TV mm-2
Quadro 1 - Principais indicadores histomorfométricos ósseos [45]