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O teste hipo-osmótico (HOST) foi desenvolvido para avaliar a integridade funcional das membranas de espermatozóides humanos (Jeyendran et al., 1984), citado por Peña Martínez (2004) e, posteriormente, adaptado para várias espécies de mamíferos.

Kumi-Diaka (1993) avaliou a resposta do sêmen canino ao HOST e a

associação entre essa resposta e as variáveis seminais, inclusive após aquecimento e armazenamento obtendo, como na espécie humana e bovina, o engurgitamento dos espermatozóides caninos sob condições hiposmóticas devido ao influxo de água e expansão da membrana espermática. O número máximo de espermatozóides reagidos ao teste foi observado em solução de frutose 60 mosmol após período de incubação de 45 minutos sendo que uma alta correlação (r = 0,94; r2 = 0,88; P<0,0001) foi observada entre a porcentagem de espermatozóides reagidos e a motilidade espermática de tal sorte que, em função dessas variáveis, a equação de regressão Cu = 0,49Mo + 46,46 (P<0,0001) foi estabelecida, onde Cu = porcentagem de espermatozóides reagidos ao HOST. Ainda não se encontrou na literatura uma pesquisa que correlacione o HOST e a motilidade progressiva obtida pelo CASA o que poderia, a priori, ser de extrema relevância para os trabalhos com biotecnologia de sêmen canino.

Kumi-Diaka & Badtram (1994) avaliaram o efeito do armazenamento do sêmen canino resfriado a 5ºC por 24h sobre a integridade da membrana espermática, avaliada pelo HOST, não encontrando resultados diferentes para sêmen resfriado e a fresco. No entanto, ao avaliarem no sêmen resfriado as correlações entre o HOST e a motilidade (r = 0,87, P<0,05) e HOST x reação acrossômica (r = 0,56, P<0,05) os resultados foram significativos ratificando a viabilidade do HOST como teste de valor preditivo para a viabilidade espermática e, inclusive, para o rastreamento de machos subférteis com espermiogramas aparentemente normais.

England & Plummer (1993) também descreveram a competência de reação do espermatozóide canino sob condições hiposmóticas e afirmaram ser o número de espermatozóides reagidos ao HOST inversamente proporcional ao número de células mortas na amostra,

no entanto, não encontrando correlações significativas com a motilidade espermática, morfologia ou coloração vital.

Eilts (2005) levantou diversos estudos em que o HOST foi utilizado como ferramenta para análise de integridade funcional de membranas espermáticas e constatou, intrigantemente, que até a data da publicação de sua revisão nenhuma publicação sobre a utilização do HOST para avaliação de sêmen canino congelado havia sido realizada e também nenhuma associação direta com fertilidade havia sido tentada.

Nesse ínterim, Chirinéa et al. (2006), com o objetivo de avaliarem as características morfofuncionais do sêmen canino refrigerado e congelado utilizando dois diferentes diluidores, apresentaram resultados reveladores. Embora não tenham verificado diferenças significativas das características morfofuncionais avaliadas pelo HOST após a descongelação (25,2±7,1 versus 34,1±14,2%, P>0,05), os autores apontaram uma redução de 48,9% na integridade das membranas espermáticas entre o T1 (sêmen a fresco) e T2 (sêmen resfriado a 5ºC por 1h), ambos no meio TRIS+8% glicerol, dados contrastantes com os de Kumi- Diaka & Badtram (1994) e provavelmente gerados pela adição do glicerol. Segundo Gunzel-Apel et al. (1993), que utilizaram dois diferentes métodos CASA para analisarem a motilidade, velocosdade e linearidade dos espermatozóides caninos, diluídos em meio Tris-gema sem e com a adição de glicerol (4, 6 e 8%), após 10 minutos da adição do crioprotetor interno, a motilidade que era 93,1±2,9% no sêmen diluído apenas no TRIS-gema apresentou uma tendência de redução (88,0±3,8, 83,7±4,9 e 78,6±6,3%) quando em contato com os meios que continham glicerol, elencados pela concentração crescente.

1.9.3.2 Sondas Fluorescentes

A integridade de membrana dos espermatozóides caninos pode ser avaliada por diferentes métodos de coloração, embora o uso do glicerol e da gema de ovo em grande parte dos diluidores para congelação de sêmen interfira com a maioria dos fixadores usados para coloração diferencial pós- descongelação (Peña Martinez, 2004). Entretanto, os corantes fluorescentes eliminaram essas dificuldades e se tornaram o método de escolha para avaliação do sêmen pós-descongelação (Schafer-Somi & Aurich, 2007).

Com o auxílio dos corantes fluorescentes carboxifluoresceína diacetato (CFDA) e iodeto de propídio (IP) é possível acessar a integridade de membranas espermáticas por meio da imobilização das mesmas com baixíssimas concentrações de formaldeído. As células coradas individualmente por esses corantes fluorescentes podem ser observadas em uma suspensão por meio de um microscópio de fluorescência sendo, assim, útéis para demonstrar a sensibilidade da membrana plasmática do espermatozóide ao choque térmico pelo frio (Harrison & Vickers, 1990) ou, após a descongelação, durante um teste de termo-resistência sob incubação a 38ºC por 3 horas (Rota et al., 1997).

Segundo Harrison & Vickers (1990) e Schäfer-Somi & Aurich (2007), o CFDA, permeável às membranas celulares, provoca a liberação de carboxifluoresceína-livre impermeável intracelular por esterases inespecíficas de células vivas e seu acúmulo e fluorescência (verde) nos acrossomas e mitocôndrias, tanto quanto no citoplasma dos espermatozóides. A maioria dos espermatozóides intactos acumula carboxifluoresceína em todos os compartimentos. Poucas células com membranas plasmáticas danificadas acumulam o corante somente no acrossoma e/ou nas mitocôndrias,

enquanto outras com membranas danificadas permanecem inteiramente não coradas. O IP, impermeável, não cora nenhum dos espermatozóides intactos, os quais acumulam CFDA, mas coram todos os outros (cabeças apresentam fluorescência vermelha).

Ao avaliarem a integridade de membranas de espermatozóides caninos pós-congelação em diferentes diluidores utilizando tanto uma associação IP com uma sonda fluorescente de DNA membrana-permeável (SYBR-14), sob leitura objetiva direta pelo sistema CASA Sperm Vision (Sperm Vision, Minitüb, G), assim como a coloração pelo CFDA, sob leitura subjetiva em microscópio ótico de fluorescência, Schäfer-Somi & Aurich (2007) determinaram que, após diluição em meio TRIS, a integridade de membranas das amostras determinada com a associação SYBR-14/IP e com o corante CFDA apresentram correlação significativa (R= +0,686; P<0,01) e que a coloração pelo CFDA não apresentou diferenças entre os diferentes diluidores utilizados.

Como vantagens da associação de corantes SYBR-14/IP sobre o corante CFDA Schäfer-Somi & Aurich (2007) apontaram a independência de atividade enzimática intra-celular e não geração de coloração de fundo, além de maior estabilidade. Outra vantagem apontada foi a possibilidade da leitura automatizada pelo Sperm Vision que proporcionou avaliação de muitas amostras em um curto intervalo de tempo com redução da influência do técnico. No entanto, como desvantagens, destacaram a motilidade pós-incubação dos espermatozóides com membrana intacta (verdes), o que causou problemas com o reconhecimento das células pelo sistema de análise, além do não reconhecimento e diferenciação dos compartimentos danificados, como é possível de ser avaliado por meio da coloração com o CFDA.

Ao correlacionar uma técnica até então não descrita para coloração de sêmen canino com sondas fluorescentes e o CFDA, Peña et al. (1999) avaliaram a viabilidade espermática pós- descongelação do ejaculado de 10 cães processados sob dois conhecidos métodos de congelação. A integridade da membrana plasmática e a reação acrossômica dos espermatozóides foram avaliadas simultaneamente por citometria de fluxo utilizando uma combinação de três sondas fluorescentes: a Carboxi-SNARF-1, que identifica espermatozóides vivos; o Iodeto de Propídio e o Isotiocianato de Fluoresceína conjugado à Aglutinina de

Pisum sativum, que se liga ao conteúdo

acrossomal dos espermatozóides com membrana plasmática ou acrossomal externa danificadas.

De acordo com os resultados daqueles autores, a correlação CFDA-IP

versus SNARF-IP para espermatozóides

vivos foi 0,964 (P<0,0001) enquanto para espermatozóides mortos foi 0,963 (P<0,0001). Os resultados demonstraram também que, uma vez que uma reação acrossomal falsa envolve uma rápida perda da integridade da membrana plasmática, esse teste de viabilidade pode ser adotado como um indicador indireto da

reação acrossômica dos espermatozóides pós-descongelação.

1.10 – A inseminação artificial com