Overbærenhet/toleranse

Atualmente, a maior parte dos modelos in vitro utilizados na identificação de novas moléculas com potencial anticancer são baseados em tipo histológico. Contudo, sabe-se que o câncer representa um conjunto complexo de alterações genéticas e epigenéticas que por consequência apresenta diferentes subtipos moleculares (SORLIE et al., 2001; SORLIE et al., 2003). Isso implica em dizer que apesar da similaridade histológica aparente dos mesmos tipos de tumores, os subtipos moleculares se diferem em termos de diferenciação, resposta terapêutica e sobrevida (PRAT et al., 2010). Portanto, o desenvolvimento de modelos celulares que, diferentemente daqueles já utilizados durante as prospecções de novas substâncias, apresentem apenas uma única via alterada, na tentativa de aumentar a precisão do estudo de mecanismo de ação e alvo de durante a triagem por novas moléculas na cadeia de desenvolvimento de fármacos é de grande valia.

Os trabalhos com edição gênica exigem que se tenha claro conhecimento sobre a estrutura e função do gene em estudo. Sabe-se que um mesmo gene pode expressar mais de um transcrito, fruto de um splicing alternativo, isto é, leitura diferente dos éxons disponíveis para transcrição que podem gerar isoformas diferentes, ou seja, proteínas com terminações N- e C- distintas (SHABALINA et al., 2010; NILSEN & GRAVELEY, 2010). Portando, antes de qualquer passo no trabalho com edição gênica, faz-se necessário conhecer a estrutura e função do gene em estudo para que, independentemente do transcrito, a modificação realizada gere a alteração proposta.

Sabendo que o oncogene C-MYC é altamente expressão em tumores humanos e contribui para o crescimento desordenado de células de pelo menos 40% dos cânceres, este gene apresenta-se como um importante alvo terapêutico (DANG et

al., 2012). Tanto em humanos quanto em roedores, já foi observado que mutações

pontuais em C-MYC são responsáveis pelo aumento da ação do fator de transcrição do gene (HEMANN et al., 2007).

Utilizando as informações disponíveis no banco de dados do NCBI (do inglês National Center for Biotechnology Information), Genbank, pode-se estudar as sequências certas para cada edição. No caso do c-Myc, dos quatro transcritos existentes apenas dois apresentam um resíduo de treonina na posição 58. Entretanto, segundo Wang e colaboradores (2011), as duas isoformas em que a mutação T58A pode estar presente são as mais traduzidas das quatro.

A reprodução da mutação T58A in vitro através da substituição de apenas um nucleotídeo exige que o mecanismo de HDR seja a via utilizada para edição. Sabendo que quando o vetor for expresso e o sistema CRISPR/Cas9 exercer seu papel dentro das células, o mesmo somente vai parar de gerar DSB quando a sequência alvo reconhecida pelo gRNA gerar indels suficiente para impedir que o guia volte a parear na região alvo de DNA (PEREIRA, 2016). Contudo, a partir do momento em que o mecanismo de reparo via HDR ocorrer e inserir a mutação pontual desejada, qualquer outra modificação que um próximo vetor venha a gerar, secundariamente, será negativa para o desenvolvimento do modelo, tendo em vista que a única alteração desejada é a T58A.

Inicialmente, para contornar essa possível alteração secundária, deve-se ter em conta que o guia está dentro da própria zona de edição (figura 7 - A), isto é, entre o códon a ser alterado (vermelho) e o sítio de clivagem pela enzima Cas9 (seta) e que essa zona de edição seja correspondente (complementar) a parte do óligo doador a ser inserida. Dado isso, utilizou-se do princípio de que o terceiro par de base de um códon pode ser alterado e mesmo assim codificar um mesmo aminoácido, bases oscilantes (NELSON & COX, 2011).

Logo, as bases oscilantes dos códons que compõe o óligo doador a ser utilizado como molde no reparo ao DNA poderiam ser alteradas, sem necessariamente alterar tradução dos aminoácidos (figura 16). As bases oscilantes do óligo foram alteradas na maneira que segue: CTG por CTA (ambas leucinas); TCC por TCA (ambas serina); CCG por CGA (ambas prolina); AGC por AGT (ambas serina); CGC por CGA (ambas arginina). Isso significa dizer que uma vez o knockin ocorra adequadamente, um próximo gRNA não reconhecerá a sequência alvo novamente.

Segundo Semenova e colaboradores (2011), o gRNA é capaz de reconhecer uma sequência com poucos nucleotídeos não pareados, entretanto a menor alteração na sequência seed do guia funcionará como um bloqueio no pareamento.

Figura 16. Representação da inserção do óligo doador e suas características.

Representação do óligo doador com seus braços homólogos. A sequência em azul é a zona de edição, região de inserção, onde na sua extremidade 5´ temos o códon a ser modificado (sublinhado) de alanina (ACC), onde apresenta uma alteração de adenina (A em vermelho na fita de DNA alvo) por guanina (G em vermelho na fita do óligo). demais alterações em nucleotídeos representam as modificações nas bases oscilantes do óligo. Traço verde indica o PAM, traço azul a sequência seed e traço preto a extensão da sequência do guia. Seta contínua indica que a substituição de citosina por adenina está inserida no seed, enquanto a seta pontilhada indica a DSB. Fonte: Elaborado pelo próprio autor.

O desenho do gRNA para Trp53 objetivou levar a enzima Cas9 para gerar DSB com maior chance de alteração de quadro de leitura. Segundo Pereira (2016), para o nocaute de um gene por CRISPR/Cas9 através da formação de indels é de extrema importância para gerar mutações o mais perto possível da porção aminoterminal da proteína, pois assim maior será o número de aminoácidos modificados e, consequentemente, maior será a garantia da inativação gênica. Seguindo esse perfil, a probabilidade de produção de uma proteína não funcional pode

ser de 60% a 70% (MEI et al., 2016). Portanto, a região escolhida para o desenho do guia para Trp53 foi o primeiro éxon do gene (figura 7 – B).

Tendo em vista que a clivagem no DNA acontece três nucleotídeos a partir do domínio PAM no sentido sentido 5’ (upstream), a quebra de dupla fita acontece entre os 15º (adenina) e 16º (timina) primeiros nucleotídeos da região codificante do gene. Em camundongos, Trp53 apresenta a expressão de três transcritos, porém o primeiro éxon é comum a todas eles (HSU et al., 2014; MEI et al., 2016).

O gene H19, possui um padrão de expressão monoalelica, cuja regulação da sua função se dá por uma região controladora de imprinting (ICR, do inglês, Imprinting

Control Region), localizada upstream do promotor do H19, denominada H19DMR, por

ser diferencialmente metilada dependendo da origem parental (GEBERT et al., 2010). O fator de transcrição CTCF (fator de ligação CCCTC) é conhecido por ser o principal fator que se liga à ICR quando esta não está metilada, reestruturando a arquitetura do DNA em um loop até o promotor do H19, ativando-o (LI et al., 2008).

Portanto, apesar do controle da expressão desse gene acontecer pela H19DMR, a deleção do promotor garante a inativação do gene. Para isso, sabendo que a sequência conservada em eucariotos TATAAA (TATA BOX) caracteriza um dos principais pontos de reconhecimento da região promotora, a retirada dessa sequência induz diretamente no bloqueio da expressão (NELSON & COX, 2011). Portanto, desenhou-se dois gRNA que flanqueiam a região promotora do H19 para a deleção do mesmo (figura 7 – C).

A etapa de digestão do plasmídeo garante que o vetor px458 esteja apto para ser trabalhado. Como visto, o padrão linearizado foi obtido pois a corrida de eletroforese evidenciou que ele se encontrava em uma altura intermediária. Embora todas as bandas estivessem perto do tamanho do plasmídeo 9289 pb, pois todas continham o mesmo arcabouço, algumas apresentaram diferentes enovelamentos. A forma circular relaxada se apresentou mais pesada e a super espiralizado se apresentou mais leve, pois suas conformações fizeram com que que elas apresentassem mais e menos resistência no gel de agarose, respectivamente (HUANGJIN et al., 2014).

Para a digestão do plasmídeo, utilizou-se da enzima de restrição BbsI que apresenta sítio de clivagem logo após o promotor U6, na região própria para inserção do guia (figura 7). As enzimas de restrição são endonucleases que podem ser purificadas a partir de bactérias e que reconhecem sequências específicas, de 4 a 8 pb, clivando em seguida as duas fitas de DNA nesse mesmo sítio (ALBERTS et al., 2010). Sabendo que a BbsI não deixa as extremidades da quebra do plasmídeo coesiva, o vetor dificilmente volta a se linearizar sem o inserto. Contudo, faz-se necessário adicionar uma sequência coesivas de quatro nucleotídeos nas extremidades dos guias, CACC para o guia senso e AAAC para o anti-senso. Além da adição da sequência coesiva, adiciona-se uma guanina no começo de cada gRNA para o funcionamento correto do promotor (MIYAGISHI & TAIRA, 2002; ROMANIENKO et al, 2016).

Somente após a etapa de transformação em bactéria competente podemos confirmar a ligação dos gRNA ao plasmídeo px458. Na natureza, os plasmídeos são transferidos naturalmente pelo contato direto entre duas bactérias pelo processo de conjugação. Na engenharia genética foram criados métodos similares in vitro que auxiliam na transformação genética de bactérias (DIONÏSIO, et al., 2005).

A transformação em bactérias competentes promove a diminuição repentina da temperatura do sistema criando diferença de pressão entre o exterior e o interior da célula induzindo a formação de poros na membrana plasmática da bactéria e permitindo que o plasmídeo entre na célula bacteriana (BROOKS et al., 2012). Os sais utilizados no processo da transformação neutralizam a repulsão eletrostática entre o DNA plasmidial e a membrana celular bacteriana antes de iniciar o choque de temperatura, assim como facilitam a formação de poros na parede bacteriana (TORTORA, 2012). Portanto, os plasmídeos entraram nas bactérias hospedeiras sensibilizadas ao choque e se multiplicaram utilizando a maquinaria da própria célula hospedeira (KLUG et al, 2010).

Sabendo que o plasmídeo px458 apresenta em sua estrutura um gene de resistência ao antibiótico ampicilina, a identificação de colônia que receberam o vetor se torna visual, pois o meio de plaqueamento apresenta em sua composição ampicilina. O resultado da PCR de colônia confirma a reação de ligação dos guias ao

vetor, pois um o iniciador senso se anela necessariamente ao gRNA introduzido no vetor, enquanto o iniciador anti-sento se anela dentro do arcabouço do vetor, de modo que se a ligação entre o plasmídeo e o guia não ocorrer, não haverá produto formado na PCR (figura 17) (KENKEL, 2016). Logo, o peso correto esperado e obtido no gel de eletroforese para cada vetor ligado ao seu gRNA é de 349 pb, distância entre os iniciadores (figura 10).

Figura 17. Representação do posicionamento dos iniciadores para PCR de colônia.

Representação do plasmídeo px458 ligado ao gRNA. Setas indicam a posição dos iniciadores, onde o senso está sobre gRNA (inserto) e anti-senso dentro da estrutura do vetor. Logo, a reação de ligação pode ser avaliada por PCR. Fonte: Adaptado de Addgene, 2016.

O processo de transfecção por eletroporação dos componentes do sistema Crispr podem ser administrados de três formas nas células: DNA contendo o vetor de expressão da enzima Cas9 + gRNA; mRNA da enzima + gRNA; peptídeo da enzima + gRNA. Dentre a vantagens de se usar o vetor de expressão podemos citar a facilidade de manipulação do material, possibilidade de clonagem, estabilidade na célula e pouco custoso (KALEBIC et al., 2016; CHU et al., 2016). Em um trabalho comparativo de edição de DNA através das diferentes formas de administração supracitadas, Kumar e colaboradores (2016) comprovaram eficiência em todos os modos de transfecção dos componentes. A edição por transfecção do vetor embora avaliada como a menos eficiente, comparada com os outros métodos, apresentou eficiência de até 50% de

edição. Não somente, Kaneko e seu grupo (2015) foram responsáveis pela construção de um rato mutante utilizando da técnica de eletroporação de vetor circular em zigoto, muito embora a eficiência da edição tenha sido baixa, inferior a 10%.

A etapa final da construção de um vetor de CRISPR/Cas9 é a avaliação da capacidade do mesmo em gerar DSBs, ou seja, inserções e deleções pela via NHEJ. Isso significa dizer que o vetor é posto em prática dentro das células e tem sua atividade confirmada como previsto in silico ou não. Diferentes formas de validação da atividade do vetor da CRISPR/Cas9 estão disponíveis, desde ensaios mais demorados e custosos como sequenciamento de DNA, até ensaios mais baratos que utilizem de digestão enzimática, utilizando sítios de restrição que foram alterados, e ensaios enzimáticos de clivagem de bases não pareadas (EMC), sendo esse último o mais rápidos e de prática aplicação (VOUILLOT et al., 2015; YANG et al., 2015).

Optou-se por realizar o ensaio EMC com a T7 endonuclease (T7E) por ser um método mais simples, fornecendo resultados através de eletroforese. A T7E também é compatível com uma gama ampla de tampões de PCR e não necessariamente requer a purificação do produto de PCR antes da digestão. O que se deve ter claramente em conta é que atividade da T7E é sensível a concentração de DNA, bem como a temperatura e tempo de incubação com a enzima (MEAN et al., 2004).

Esse ensaio funciona através da detecção de clivagem de mismatches, erros de pareamento de heteroduplex formados por uma fita de DNA selvagem e uma fita que sofreu com a formação de Indels. Isso acontece pelo fato de um pool de células que passaram pelo processo de transfecção com os vetores construídos passarem por um ciclo de desnaturação/anelamento. No caso desse teste, o resultado esperado é a geração de DSBs induzidas por CRISPR/Cas9 e reparadas via NHEJ. Isso significa dizer que na amostra de DNA editado, haverá a presença de uma banda com maior peso seguido por duas bandas de pesos menores, fruto da clivagem de mismatches (VOUILLOT et al., 2015).

Sabendo que a eficiência da clivagem da enzima T7 depende de no mínimo dois nucleotídeos mal pareados, podemos inferir que a geração de inserção ou deleção

de pares de bases foi superior a somente um erro de pareamento (VOUILLOT et al., 2015). Além disso, a qualidade do ensaio da T7E é garantida para fragmentos de até 1000 pb (QIU et al., 2004) e neste trabalho o maior fragmento a ser tratado com a enzima tem 400 pb, garantindo a eficiência do teste. Como já mencionado, para se obter como resultado final a criação de modelos in vitro com características próprias, a etapa de validação de atividade dos vetores px458-gRNA-c-Myc, px458-gRNA-Trp53 e px458-gRNA-H19 é crucial.

A atividade vista na edição de c-Myc se mostrou completamente eficiente, pois a clivagem de DSB pode ser observada com clareza nos padrões de pesos já esperados (figura 12 – A). Em um trabalho de avaliação se fatores gerados por células T e de β-catenina são responsáveis por parte da regulação de C-MYC, Rennoll e colaboradores (2016) utilizaram do vetor px260 para induzir indels na região de ligação desses fatores em C-MYC. O vetor por eles utilizado é muito semelhante ao px458, com tamanho e composição semelhantes (CONG et al., 2013). A validação do vetor foi confirmada pelos autores através de ensaios enzimáticos de clivagem de bases não pareadas, muito embora o próprio autor afirme que a eficiência da reação enzimática foi baixa (0.6% de indels), entretanto suficiente para confirmar a capacidade de edição do vetor testado.

Um perfil muito similar ao de c-Myc foi obtido com a edição do vetor px458- gRNA-Trp53, pois as bandas de 179 pb e 129 pb podem ser visualizadas na corrida do gel de eletroforese. A confirmação de edição em Trp53 via CRISPR/Cas9 já havia sido testada em outros organismo. Wang e parceiros (2015) também obtiveram sucesso na validação da edição do gene, onde através do ensaio da T7, três dos seis guias desenhados para TRP53 de macaco (Macaca fascicularis) apresentou uma faixa de 17% até 34% de criação de indels na região de interesse do noucateamento. Inclusive, modelos murinos já foram engenheirados, como é o caso do modelo para tumor de carcinoma seroso de alto grau de ovário, onde através da geração de indels no éxon três do gene do camundongo houve a confirmação do Trp53-/- vista por imunohistoquímica e imunoblot (WALTON et al., 2016).

Em algumas situações, a deleção da sequência completa do gene ou regiões regulatórias são mais interessantes do que gerar mutações pontuais (seja por NHEJ ou HDR) (SANDER & JOUNG, 2014). Isso porque mutações desse tipo eventualmente geram alelos não nulos, que permitem uma atividade ainda que parcial do gene (MEI et al., 2016). Logo, a via por deleção ocorre por intermédio de duas quebras na dupla fita, empregando-se dois vetores em que cada um contenha duas sequências distintas de gRNA flanqueando a região alvo (JUNQUEIRA & NUNES, 2016). Especialmente para H19, o nocaute via NHEJ não se torna uma opção viável visto que modificações pequenas no transcrito primário podem não ser suficientes para impedir sua ação moduladora. Portanto, o silenciamento por deleção se torna uma alternativa mais precisa.

A deleção de promotores para eficiente silenciamento gênico é uma ferramenta interessante e apresenta vantagens em comparação à estratégia de deleção de genes inteiros, como o simples fato de ser um alvo menor (LEIGHTON et

al., 1995; THORVALDSEN et al., 2002). A deleção de sequências menores pode

garantir, com maior grau de certeza, que a perda da função do gene é a razão de uma eventual alteração fenotípica, visto que deleções de largas sequências pode levar a rearranjos não previstos (BARAU et al., 2016). Além do fato de grandes deleções serem difíceis de serem identificadas através de rastreamento por PCR convencional (BOLUKBASI et al., 2016). Para contornar essa imprecisão, os vetores de CRISPR/Cas9 foram desenhados para flanquear e consequentemente deletar uma região de extensão de 1546 pb da região promotora ao invés do gene por completo de 2617 pb.

De acordo com a figura 12 – C, podemos observar que os vetores de deleção px458-gRNA-H19 upstream e downstream alcançaram eficiência ao gerarem indels reconhecidos pela T7 endonuclease. Trabalhos de validação similares de Crispr/Cas9 porém para deleção de DMR de H19 já foram estabelecidos. Zhong e colaboradores em 2015 demonstraram a interferência de genes controlados por

imprinting genômico sobre a viabilidade de espermatozoides de camundongo pela

Embora confirmadas a funcionalidade dos vetores projetados pelo teste enzimático, por questões de avanço no desenvolvimento do trabalho, a linhagem com deleção do promotor de H19 foi mantida em experimento. Onde na sequência, os vetores construídos para essa função foram novamente transfectados nas células murinas C2C12 para o isolamento de células através de diluição.

Sabe-se que existem diferentes tecnologias ou metodologias para se trabalhar com o isolamento de células e dentre os meios manuais a diluição limitada é um dos mais utilizados (GROSS et al., 2015). Pode-se estimar um aproveitamento próximo a 13% em relação ao número total de poços plaqueados (seis placas de 96 poços) e o número de poços utilizados para avaliação por PCR (76 poços). Contudo, esse valor aparentemente baixo é esperado para este tipo de diluição, isso porque a probabilidade de se obter um número de células por alíquota, por exemplo 0, 1 ou 2 células por poço, é variável (FULLER et al., 2001). A fim de se alcançar uma probabilidade suficientemente alta para o aparecimento de apenas uma célula por poço e, ao mesmo tempo, minimizar a probabilidade de múltiplas células, a amostra de células deve ser fortemente diluída (SMITH et al., 2007).

Os produtos de amplificação da colônia C21 (figura 14 – C), variaram entre uma margem de 100 pb na sua altura no gel de agarose, 1.7 kb e 1.6 kb, deixam claro a presença de dois tipos de DNAs na amostra utilizada na PCR e, portanto, na colônia 21. O produto de 1.7 kb da colônia está muito próximo aquele visto no controle negativo. O que leva a crer possivelmente que seja um DNA não modificado. Já o produto inferior, 1.6 kb, não existente no controle, deixa margem para se pensar sobre uma possível deleção na estrutura da região amplificada. Para o esclarecimento desse último resultado, o produto da banda de 1.6 kb foi sequenciado e como mostrado na figura 15 – C, o alinhamento entre a amostra da C21 e o genoma de referência apresenta um intervalo de aproximadamente 80 pb na sequência do DNA de C21. Possivelmente essa delação de 80 pb seja a responsável pela diferença de alturas entre os produtos visto no gel de agarose.

Sabendo que a colônia em análise teve um desenvolvimento monoclonal, isto é, a partir de uma única célula, acredita-se que os resultados acima citados

estejam relacionados a uma deleção monoalélica do gene. De fato, diferentes autores afirmam já ter identificado pequenas deleções monoalélicas em seus trabalhos. Yarui e colaboradores (2016) observaram a deleção de apenas 16 pb em um único alelo do gene para expressão de eGFP, onde as células modificadas com a expressão da proteína tiveram a fluorescência do marcador muito reduzida.

Shin e parceiros (2017), em trabalhos de edição de zigotos de camundongo, avaliaram o padrão de deleção de 17 regiões do genoma murino. Em seus resultados, os autores mostraram que as deleções via Crispr/Cas9 por eles trabalhadas tiveram prevalência assimétrica nos alelos avaliados. Além disso, esse mesmo grupo identificou deleções de até 600 pb induzidas por somente um único gRNA, ao invés de dois. Não somente, estudos utilizando de gRNAs para flanquear regiões de deleção também já foram associados a inversões da própria sequência a ser deletada, ao invés