Outline of the thesis

A validação das metodologias para quantificação de RSP em comprimidos revestidos e de RSP e seu principal produto de biotransformação, a 9OH-RSP, em amostra de plasma, foi realizada de acordo com as normas da Resolução nº 899 de 2003 da ANVISA e os seguintes parâmetros foram analisados: precisão, exatidão, especificidade,

limite de detecção, limite de quantificação, linearidade, robustez e estabilidade das soluções-padrão. A olanzapina foi utilizada como padrão interno (IS) nas análises em plasma.

4.3.2.1 Precisão

Segundo a ANVISA “precisão é a avaliação da proximidade dos resultados obtidos em uma série de medidas de uma amostragem múltipla de uma mesma amostra” (Brasil, 2003c).

Para a determinação da precisão para a análise dos comprimidos foram analisadas amostras controles em três concentrações diferentes: concentração baixa (5 µg/mL), concentração média (10 µg/mL) e concentração alta (25 µg/mL). As análises realizadas no mesmo dia determinaram a precisão intra-dia com um n = 6 para cada concentração e, as análises realizadas em três dias diferentes e consecutivos determinaram a precisão inter-dia com um n = 18 para cada concentração. Os resultados foram expressos como média, desvio padrão relativo e/ou coeficiente de variação (%) dos resultados obtidos das análises.

Para a determinação da precisão para a análise de plasma foram analisadas amostras controles em três concentrações diferentes: concentração baixa (5 ng/mL), concentração média (20 ng/mL) e concentração alta (40 ng/mL).

4.3.2.2 Exatidão

A exatidão de um método analítico é a proximidade dos resultados obtidos pelo método em estudo em relação ao valor real, devendo ser determinada após o estabelecimento da linearidade, do intervalo linear e da especificidade do mesmo.

A exatidão foi determinada a partir de 18 determinações para cada amostra controle, sendo as mesmas utilizadas no ensaio de precisão, sendo expressa pela relação entre a concentração média determinada experimentalmente e a concentração teórica correspondente, de acordo com a equação (1):

Exatidão = concentração média experimental/concentração teórica x 100 Eq (1)

4.3.2.3 Especificidade

Especificidade pode ser definida como sendo a capacidade que o método possui de medir exatamente um composto na presença de outros componentes tais como impurezas, produtos de degradação e componentes da matriz.

Este parâmetro foi determinado a partir da comparação dos cromatogramas das soluções-padrão de RSP com os dos comprimidos da mesma substância, com subsequente análise da presença de interferentes no tempo de retenção da RSP. Picos bem resolvidos e simétricos demonstraram a especificidade do método.

Para a determinação da especificidade do método bioanalítico, foram utilizadas amostras de plasma branco obtidas de indivíduos sadios, sendo

tais amostras classificadas em: normais, lipêmicas e hemolisadas. Os resultados foram comparados com aqueles obtidos com solução aquosa dos analitos.

4.3.2.4 Limites de detecção e de quantificação

O limite de detecção é a menor quantidade do analito presente numa amostra que pode ser detectado, porém não necessariamente quantificado, sob as condições experimentais estabelecidas, devendo ser de 2 a 3 vezes superior ao ruído da linha de base. Tal parâmetro foi determinado através da análise de plasma contendo soluções-padrão com concentrações conhecidas e decrescentes de RSP e 9OH-RSP, até o menor nível detectável.

O limite de quantificação é a menor quantidade do analito, presente em uma amostra, que pode ser determinada com precisão e exatidão aceitáveis, sob as condições experimentais estabelecidas, devendo ser, no mínimo, cinco vezes superior a qualquer interferência da amostra branco no tempo de retenção do fármaco.

Estes parâmetros foram determinados por meio da análise de soluções contento concentrações conhecidas e decrescentes da RSP (comprimidos revestidos) ou de plasma contento concentrações conhecidas e decrescentes da RSP e 9OH-RSP até o menor nível determinável com precisão e exatidão aceitáveis.

4.3.2.5 Linearidade

Linearidade pode ser definida como a capacidade de um método analítico tem de demonstrar que os resultados obtidos são diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra, dentro de um intervalo especificado, sendo que o coeficiente de correlação (R2_{) deve ser igual ou} superior a 0,99, segundo as normas da ANVISA (Brasil, 2003c).

A determinação da linearidade foi efetuada a partir da construção de uma curva de calibração de soluções-padrão de RSP em diversas concentrações conhecidas, sendo 10 concentrações para o método para análise plasmática e 11 concentrações para o método para análise dos comprimidos.

A curva de calibração representa a relação entre a resposta do instrumento e a concentração conhecida do analito, representada neste estudo pela área do pico cromatográfico. Para a determinação deste parâmetro foi construída uma curva de calibração extraída com 10 pontos, utilizou-se plasma como matriz biológica. Foi estabelecida a correlação linear entre concentração e área do pico.

4.3.2.6 Robustez

A robustez de um método analítico pode ser definida como a medida de sua capacidade em resistir a pequenas e deliberadas variações dos parâmetros analíticos indicando sua confiança durante o uso normal. Para a determinação da robustez foram efetuadas pequenas variações nas

seguintes condições cromatográficas: pH, fluxo do sistema cromatográfico e coluna cromatográfica.

4.3.2.7 Estabilidade

Para a análise da estabilidade das soluções-estoque foram selecionadas três amostras-controle com valores conhecidos e independentes: 5, 10 e 25 g/mL. As soluções foram mantidas à temperatura ambiente por 24 h, à temperatura de -20 ºC e -80 ºC e analisadas com 7, 15, 30 dias após a data do preparo.

Informações sobre a estabilidade dos analitos na matriz biológica são necessárias para garantir que tais analitos não sofram alterações entre o período da coleta e o momento da análise. A estabilidade dos analitos (RSP, 9OH-RSP e padrão interno) foi determinada a partir de: (a) ciclos de congelamento e descongelamento de três amostras das concentrações baixa e alta: as amostras foram mantidas congeladas a -20 ºC por 24 h sendo então submetidas ao descongelamento à temperatura ambiente e após o descongelamento foram congeladas novamente por 24 h a -20 ºC e assim sucessivamente até completar os três ciclos. Os resultados foram comparados com aqueles obtidos da análise das amostras recém- preparadas; (b) para estabilidade de curta duração foram utilizadas três amostras das concentrações baixa e alta as quais permaneceram por 24 h e 48 h à temperatura ambiente e, posteriormente, analisadas. Os resultados foram comparados com aqueles obtidos da análise das amostras recém- preparadas.