As fontes de inóculo foram selecionadas para cada reator em virtude da condição de temperatura de operação: mesofílica (EGSB) ou termofílica (RALF). Em ambos os casos, a fim de se obter comunidades produtoras de hidrogênio o lodo foi submetido a um pré- tratamento térmico de acordo com a metodologia adaptada de Kim et al. (2006). O pré- tratamento consistiu de um aquecimento prévio do lodo por 10 minutos a 90oC com
monitoramento de um termômetro e, em seguida, o lodo foi colocado em banho de gelo até que a temperatura atingisse 25oC. Este tratamento térmico possibilitou a eliminação de células
vegetativas metanogênicas e acidogênicas não formadoras de endósporos e manteve as células acidogênicas com capacidade de formar endósporos, estruturas de resistência a condições desfavoráveis.
4.3.1 Inóculo do Reator Anaeróbio de Leito Fluidizado Termofílico
A fonte de inóculo utilizada para a partida operacional dos reatores RALF termofílicos foi proveniente de lodo granulado de reator anaeróbio termofílico de fluxo ascendente e manta de lodo (UASB – lodo fermentativo-metanogênico) termofílico localizado na Usina São Martinho (Pradópolis, SP), para o tratamento de vinhaça. Este lodo apresenta pH de 7,06, concentração de sólidos voláteis totais de 41,3g.L-1.
4.3.2 Inóculo do Reator Anaeróbio de Leito Granular Expandido
Mesofílico
A fonte de inóculo utilizada para a partida operacional dos reatores EGSB mesofílicos foi proveniente de lodo granulado de reator UASB mesofílico localizado na Avícola Dakar S/A (Tietê, SP), para o tratamento de água residuária de abatedouro de aves. Este lodo apresenta concentrações de sólidos totais de 8,5g.L-1, de sólidos totais fixos de 1,6g.L-1 e de
sólidos totais voláteis de 6,9g.L-1.
4.4 Análises Físico-Químicas
Neste estudo foram realizadas análises físico-químicas durante a operação dos reatores para determinar os parâmetros de produção de hidrogênio e de metabólitos solúveis. Na Tabela 4.7 esta apresentada a frequência das análises físico-químicas realizadas.
A concentração de carboidratos totais de amostras provenientes das diferentes condições de operação dos reatores de produção biológica de hidrogênio foi realizada em triplicata por meio do método colorimétrico descrito por Dubois et al. (1956) utilizando glicose, para vinhaça, e lactose, para soro de queijo como padrões.
As concentrações de matéria orgânica das amostras de afluente e efluente deste estudo foram determinadas de acordo com o Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (APHA, 2012) em triplicata pelo método colorimétrico. As análises de nitrogênio foram realizadas segundo etapas de digestão , destilação e titulação (N Kjeldahl). As determinações de fósforo total (Ptotal como PO43-) foram feitas mediante digestão e
Tabela 4.7 - Frequência das análises físico-químicas realizadas
Análise Frequência Metodologia
Vazão Diária
pH Diária
Standard Methods (1998)
DQO 3x semana
ST, SST, SSV 3x semana
Nitrogênio, sulfato e fosfato Por amostra Açúcares totais
(Lactose; Glicose) 3x semana Dubois et al. (1956) Ácidos graxos e alcoóis
individuais 3x semana HPLC Shimadzu
Conteúdo do biogás (H2 e CO2) 3x semana Shimadzu GC-2010
Produção volumétrica de H2 3x semana Walker et al,(2009)
As concentrações de sulfato foram determinadas por meio da utilização de kits comerciais (HACH Dr 820 Field Test Kit®) e avaliadas por método colorimétrico. As concentrações de potássio, cálcio, magnésio, zinco, cobre foram feitas na caracterização da vinhaça de cana-de-açúcar, e realizadas por absorção atômica
e fotômetro de chama, em acordo com o Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (APHA, 2012). Para avaliar a concentração de sólidos suspensos totais, voláteis e fixos nas amostras de soro, vinhaça, afluentes e efluentes foi utilizada a filtração em membranas de microfibras de vidro (APHA, 2012). A análise de microscopia eletrônica teve como objetivo confirmar a presença e morfologia dos microrganismos aderidos aos respectivos suportes. A metodologia utilizada foi a mesma de Gonzalez et al. (2011).
4.4.1 Metabólitos Solúveis
As concentrações dos ácidos orgânicos (cítrico, málico, succínico, lático, fórmico, acético, propiônico, isobutírico, butírico, isovalérico, valérico, e capróico) e álcoois (etanol e metanol) foram determinadas por cromatografia líquida de elevado desempenho HPLC,Shimadzu®),aparelho equipado com bomba (LC-10ADVP), amostrador automático (SIL-20A HT), coluna CTO-20A, a 43 ºC, detector de arraste (SDP-M10 AVP) e coluna Aminex HPX-87H (300mm, 7,8 mm, BioRad). A fase móvel foi representada pelo H2SO4
4.4.2 Determinação de Hidrogênio e da Composição do Biogás
A determinação do gás hidrogênio foi feita por cromatografia gasosa (Shimadzu GC- 2010), sendo o aparelho equipado com detector de condutividade térmica, utilizando a coluna Supelco Carboxen 1010 Plot (30 m de comprimento e diâmetro interno de 0,53 mm). A análise de composição do biogás produzido foi feita por cromatografia gasosa utilizando seringa gas tight para retirar 0,1mL do biogás gerado no headspace em triplicada. O gás coletado foi analisado em cromatógrafo marca Shimadzu modelo GC-2010 equipado com detector de condutividade térmica. A coluna empregada foi a Sigma-Aldrich modelo Carboxen® 1010 Plot e coluna de sílica fundida, a coluna possuía 30m de comprimento e diâmetro interno 0,53mm. O gás de arraste utilizado foi o Argônio sob fluxo de 21,9cm2.s-1.
As temperaturas do forno, da coluna e do detector foram 130oC, 220oC e 230oC.
A produção volumétrica de todo o biogás formado no reator foi medida por meio do método de deslocamento de fluido adaptado de Walker et al. (2009). Nesta medida, o biogás gerado percorreu um tubo de comprimento maior que 20 cm acoplado ao reator que o conecta a um recipiente pulmão contendo solução salina (NaCl) saturada com pH corrigido abaixo de 2 por H2SO4. Do recipiente pulmão, o biogás foi coletado em uma proveta graduada cheia da
solução salina por determinado período de tempo. Cada procedimento de medição da vazão volumétrica de biogás consistiu em utilizar o volume de biogás quantificado pelo descolamento da solução salina na proveta ao longo do período definido. Desta forma, todo o biogás gerado foi quantificado e o vapor de água arrastado precipita no recipiente pulmão. O valor de vazão de biogás medido foi então multiplicado pela concentração de H2 para se obter
a produção volumétrica de H2.