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LuPc

Esta secção apresenta o trabalho realizado durante o doutorado sanduíche na Espanha, no grupo da Profa. Dra. Maria Luz Rodríguez-Méndez, no departamento de Química Inorgânica, Universidade de Valladolid (Espanha), sob orientação do Prof. Dr. José António de Saja Saez. O grupo espanhol possui vasta experiência na utilização de eletrodos contendo bisftalocianinas de lantanídeos depositados via filmes LB (ou Scheffer) em sensores voltamétricos. Tais eletrodos são comumente utilizados em sensores de seletividade global chamados de “língua eletrônica” aplicados na análise de qualidade de vinhos. Propusemos, em nosso projeto, a utilização de enzima tirosinase agregando poder seletivo àqueles sensores. Desta maneira, fabricamos biossensores baseados em filmes LB contendo LuPc2 e enzima tirosinase.

3.2.2.1 Fabricação dos Filmes de Langmuir e LB

Os filmes de Langmuir e LB foram preparados em uma cuba de Langmuir KSV 2000 com volume de 1200 mL (KSV Instruments, Finlândia) ou em uma cuba de Langmuir NIMA

N N N N N N N N N N N N N N N N Lu 12 Å 3,2 Å 12 Å

(modelo 611) com volume de 450 mL (NIMA technologies, Inglaterra). Esta última, para os estudos com a enzima. Para as medidas de pressão de superfície, foi utilizado o método de Wilhelmy com um papel de filtro como sensor. As monocamadas de AA e LuPc2 foram preparadas pelo espalhamento, sobre a subfase aquosa, de 100 µL das soluções diluídas em clorofórmio. Para tal, foram preparadas soluções prévias de AA (0,5 mg.mL-1), e LuPc2 (1,2 mg.mL-1). A Solução estoque de tirosinase foi preparada em tampão fosfato (PB; 0,01M; pH 7,0; 1,68 mg.mL-1). Monocamadas mistas foram obtidas pelo espalhamento, em separado, no volume adequado para a molaridade desejada, do material anfifílico e, após, da LuPc2 (AA:LuPc2, 1:1 mol). A tirosinase foi incorporada ao filme através da injeção na subfase aquosa (NaCl 0,1 M; PB; 0,01 M; pH 7,0; Cuba KSV 2000), logo abaixo do filme de Langmuir previamente formado, por meio de uma microseringa (0,373 µg.mL-1). Essa concentração de enzima foi escolhida para se obter de 1 a 2% da razão entre a enzima e as moléculas do filme, sendo esta a concentração típica de enzima para adsorção em filmes LB (25). Em alguns casos, esta concentração foi alterada. O aumento da pressão de superfície indica a adsorção da enzima aos filmes de Langmuir mistos de AA/LuPc2. Esse aumento da pressão de superfície atingiu um platô após 80 min. As isotermas de pressão de superfície foram obtidas pela compressão da monocamada a uma velocidade de 15 mm.min-1_{. O} aumento na pressão de superfície, com o deslocamento da curva para valores maiores de área molecular média, indica a adsorção da enzima ao filme de Langmuir (42). Os filmes mistos LB contendo enzima foram depositados a uma pressão de superfície de 40 mN.m-1_{. As} velocidades típicas foram de 3 e 2 mm.min-1_{, para imersão e emersão, respectivamente. Foi} esperado um tempo de 10 min para a evaporação do solvente, antes da compressão dos filmes, em todas as medidas. Os experimentos foram realizados a temperatura ambiente (22 ± 2 °C). Os filmes LB foram transferidos em lâminas de Pt (0,7 cm x 1,2 cm) e ITO (0,5 cm x 1 cm). As deposições se iniciaram a partir da lâmina mergulhada na subfase aquosa. O estudo complementar de estabilidade da enzima adsorvida pelo ar foi realizado pela injeção de 267 µL de solução enzimática padrão (1,68 mg.mL-1) de tirosinase em solução tampão (Cuba NIMA; pH 7,0; 0,01 M; NaCl 0,1M) com pressão mantida em 15,0 mN.m-1 e tempo de espera de 90 min (a cuba permite manter o filme a uma pressão constante e quando as barreiras se mantém inalteradas por um longo período de tempo, geralmente maior que uma hora, o filme é considerado estável).

Para a limpeza das lâminas, foram utilizados três banhos consecutivos de 10 min em ultrasom: o primeiro em acetona, o segundo em clorofórmio e o terceiro em água ultrapura. As lâminas de Pt foram limpas pelo mesmo procedimento. Contudo, no segundo banho foi

Capítulo 3 – Biossensores Baseados em LuPc2 49

usado ácido nítrico a 1 M (0,456 mL de HNO3 em 10 mL de água) ao invés de clorofórmio. Espectros de Infravermelho com Transformada de Fourrier (FTIR) foram obtidos no range de 400 a 4000 cm-1 com 4 cm-1 de resolução em pastilha de KBr, lâmina de Pt, Si e cristal de ZnSe (Perkin-Elmer Spectrum 1000 System). A incorporação da enzima tirosinase aos filmes LB também foi comprovada por medidas de espectroscopia no visível, voltametria cíclica, cronoamperometria e espectroscopia FTIR.

3.2.2.2 Ensaios Enzimáticos

A atividade de uma enzima reflete a capacidade que a mesma possui de transformar um determinado substrato em produto, em certa unidade de tempo. Uma unidade enzimática para tirosinase pode ser definida como a quantidade de enzima capaz de converter 1 μmol de pirogalol por min em pH 7,0 a 30 ºC (95,96). O objetivo de estudar a atividade enzimática é determinar a quantidade de enzima ativa em solução. Para tal, observou-se a taxa inicial de formação de purpurogalina com a mudança de cor de uma solução saturada de pirogalol. A reação é catalisada pela enzima com a formação de produtos, resultando em uma solução alaranjada que absorve em 420 nm. A partir de um gráfico da variação da absorbância em 420 nm com o tempo, toma-se a parte linear da curva onde a formação de purporogalina é diretamente proporcional à absorbância. Em nosso caso, a atividade enzimática da tirosinase (Tyr) foi determinada em temperatura ambiente pela adição de 5 µL de solução padrão de Tyr (1,68 mg.mL-1_{) em 2,5 mL de solução de pirogalol a 13 mM preparada em tampão fosfato} (PB; pH 7,0; 0,01M). A variação da banda de absorção de 420 nm foi acompanhada durante o intervalo de 2 min, e os dados coletados em intervalos de 5 segundos por um espectrofotômetro Shimadzu (modelo UV-1603). A atividade enzimática foi definida como U.mL-1 de proteína sendo U a quantidade de enzima capaz de causar um aumento de 0,0001 na absorbância por min, a 25 ºC.

Para a determinação da constante de Michaelis-Menten (Km) da enzima em solução, foram medidas as atividades da Tyr a partir de concentrações de pirogalol (PB; pH 7,0; 420 nm) variando de 0,1 a 10 mM (96). Os valores dos parâmetros cinéticos foram encontrados utilizando o ajuste da curva pela equação de Henri-Michaelis-Menten e pela linearização de Lineweaver-Burk (97,98).

3.2.2.3 Medidas Eletroquímicas e Resposta do Biossensor

Medidas eletroquímicas foram realizadas com uma célula convencional de três eletrodos com o eletrodo modificado como eletrodo de trabalho, uma lâmina de Pt (área de 0,5 cm x 1,0 cm) como contra-eletrodo e um eletrodo de referência de AgCl/AgCl/KCl 3 M. Os eletrodos foram conectados a um potenciostato/galvanostato (EG&G PARTSTAT 2273, Princeton). Medidas de voltametria cíclica foram feitas por adições sucessivas de alíquotas (100 µL) de solução padrão do composto fenólico recém preparado e taxa de varredura de 50 mV.s-1. Neste caso, antes de cada adição, a célula eletroquímica era retirada para que a solução fosse agitada (por 1 min), para homogeneização. Cada medida foi repetida (ao menos três vezes) para que se avaliasse sua reprodutibilidade. Medidas de cronoamperometria foram realizadas com a aplicação de um potencial otimizado de -60 mV. Todos os experimentos foram realizados à temperatura ambiente de (25 ± 1) °C. O volume de trabalho para as medidas eletroquímicas foi de 30 mL. Todas as soluções eletrolíticas utilizadas nesta tese não foram purgadas com nitrogênio, salvo menção em contrário.