4.2 Enkeltprosjekter
4.2.3 Opplæring av alfabetiseringspersonell under APPEAL
A deteção precoce de displasia ou, num estado mais avançado, de cancro, é crucial para o tratamento e sucesso na cura da doença. O presente trabalho encontra-se direcionado para o trato gastrointestinal, onde existem algumas limitações na deteção de displasia ou cancro como, por exemplo, a impossibilidade de aceder ao intestino delgado através de endoscopia convencional e o facto de no caso da cápsula endoscópica, esta ser de sentido único e poderem existir algumas dúvidas no diagnóstico, sendo necessário recorrer a biópsias. Visto que a obtenção dos resultados de uma biópsia é um processo demorado e relativamente caro, o presente trabalho pretende obviar algumas destas limitações.
Neste sentido, o objetivo global do projeto no qual se insere este trabalho passou pelo desenvolvimento de um dispositivo que permitisse analisar o pH extracelular de biópsias, no decorrer de cirurgias, de forma a auxiliar o diagnóstico de células cancerígenas, integrado num sistema de espectroscopia desenvolvido também no âmbito deste projeto. Neste mesmo projeto está a ser desenvolvida uma matriz de microelétrodos de pH de formato planar, pelo que esta dissertação focar-se-ia no sistema de medição do pH utilizando esses microelétrodos. Contudo, como estes microeléctrodos não se encontraram disponíveis em tempo útil desta dissertação, as medições de pH foram realizadas com um elétrodo de vidro comercial.
Considerando o enquadramento do projeto, o objetivo desta dissertação passa pelo desenvolvimento da eletrónica de leitura de uma matriz de biossensores eletroquímicos que permita detetar alterações de pH em tecidos do trato gastrointestinal, pelo que a portabilidade e miniaturização do dispositivo são requisitos essenciais sendo assim fatores que justificam a seleção da tecnologia CMOS.
Com o intuito de provar os conceitos teóricos acerca do funcionamento de um elétrodo de vidro, prepararam-se 26 soluções com valores de pH que se encontram na gama de pH da zona do trato gastrointestinal alvo deste projeto, e procedeu-se à medição dos mesmos com um medidor de pH comercial. Além do valor de pH de cada uma das soluções, mediu-se também o valor da diferença de potencial correspondente a cada medição. Desta forma, foi possível determinar a curva de calibração do elétrodo de vidro em questão, verificando-se que o declive associado é de, aproximadamente, 55mV (próximo do valor teórico de 59mV). O valor da diferença de potencial por unidade de pH obtido (55 mV) é inferior ao teórico devido ao facto do elétrodo de vidro ter sido utilizado e armazenado durante longos períodos de tempo e resulta da degradação natural do elétrodo ao longo do tempo. Assim, a equação da reta de calibração obtida experimentalmente é a base da conversão do valor da diferença de potencial, medida pelo elétrodo de vidro, para o valor de pH correspondente.
Com base no requisito da portabilidade do dispositivo, utilizou-se uma bateria para a alimentação do circuito eletrónico. Além disso, selecionaram-se componentes que permitissem uma alimentação única positiva. Uma vez que o elétrodo de vidro apresenta uma impedância extremamente elevada, foi necessário selecionar e implementar um amplificador operacional comercial que servisse a aplicação. Por outro lado, como o objetivo é medir vários valores de pH em simultâneo, através de uma matriz de microelétrodos, foi necessária a implementação de um multiplexer analógico no sistema, de modo a poder enviar a medição de cada um dos elétrodos para o computador. Foi necessário ainda proceder à programação de um microcontrolador, em linguagem C, para proceder ao envio dos valores das medições para o computador, e ao desenvolvimento e programação de uma interface gráfica, em linguagem C++, para a apresentação dos resultados no PC. De modo a integrar todos os componentes
especificados e implementados no circuito analógico, desenvolveram-se placas de circuito impresso (PCB), onde todos os componentes foram soldados.
Os testes experimentais realizados ao dispositivo desenvolvido envolveram dez medições do valor de pH das 26 soluções preparadas. Os resultados obtidos permitiram calcular o valor médio de pH e o desvio-padrão para cada uma das soluções, de modo a concluir acerca do funcionamento, linearidade e fiabilidade do sistema. No que diz respeito à linearidade do sistema, os valores de pH obtidos para cada solução foram muito próximos dos valores de referência, traduzidos por um valor de 𝑅! de 99,998%. Estes resultados permitem
concluir acerca da fiabilidade do sistema, verificando-se que o dispositivo desenvolvido permite obter medições de pH idênticas ao valor de referência. Por outro lado, o cálculo do desvio- padrão para cada uma das 26 soluções permitiu aferir acerca da variabilidade das medições, sendo possível verificar se o dispositivo consegue diferenciar e distinguir diferentes soluções com valores de pH próximos. Considerando a sensibilidade de 0,05 unidades de pH definida para o projeto, estabeleceu-se que o dispositivo desenvolvido deve conseguir distinguir variações mínimas de 0,05 unidades de pH entre soluções. No que diz respeito aos resultados obtidos, verificou-se que, entre as 26 soluções analisadas, para diferenças de pH superiores a 0,05 entre duas soluções, as barras de erro resultantes da aplicação do desvio-padrão não abrangem valores iguais de pH, isto é, não se sobrepõem. Já no que diz respeito a diferenças de pH entre duas soluções inferiores a 0,05, verifica-se que entre duas soluções que apresentam uma diferença de pH de 0,04, há diferenciação das soluções, pois as suas barras de erro também não se sobrepõem. Nas restantes soluções com diferenças de pH inferiores a 0,05 verifica-se a sobreposição parcial das barras de erro, permitindo concluir que não foi possível uma distinção completa destas soluções entre si. Verificou-se, ainda, um caso onde a diferença de pH entre soluções é de 0,05 unidades de pH e houve sobreposição, embora muito pequena, das barras de erro das soluções.
Apesar dos resultados obtidos refletirem um caso onde duas soluções com diferença de pH de 0,05 apresentaram sobreposição das respetivas barras de erro, em todas as restantes soluções com diferenças de pH superiores a 0,05 verificou-se uma completa diferenciação entre soluções. Esta diferenciação é limitada pelo elétrodo e não pelo dispositivo desenvolvido uma vez que vários fatores limitam a capacidade do elétrodo obter uma precisão de 0,01 unidades de pH. A idade do elétrodo utilizado é um fator preponderante e limitante no
que diz respeito à precisão que o elétrodo consegue alcançar, sendo esta de ±0,04 unidades de pH e não de ±0,01 unidades de pH como no caso de um elétrodo novo.
Assim, conclui-se que o dispositivo foi capaz de medir corretamente o valor de pH de todas as soluções preparadas e que há distinção entre soluções com diferenças de pH de, pelo menos, 0,05. Além disso, o consumo associado ao dispositivo é de 112,5mW.
Apesar do desenvolvimento de um dispositivo compatível com tecnologia CMOS capaz de efetuar medições de pH com a sensibilidade especificada para o projeto, desenvolveu-se ainda, no software S-Edit, os dois componentes eletrónicos essenciais do circuito analógico implementado: o amplificador operacional e o multiplexer. Estes componentes foram desenhados e testados através de simulações no próprio software e obedecem, também, ao parâmetro da alimentação única positiva.
No que diz respeito ao amplificador operacional, implementou-se um já existente na bibliografia que se adapta perfeitamente aos requisitos do sistema. As correntes de entrada deste amplificador são extremamente baixas permitindo, assim, a leitura de sinais com impedâncias elevadas, como é o caso do sinal proveniente do elétrodo de vidro. Além disso, o amplificador operacional implementado apresenta uma tipologia que permite que tanto a entrada como a saída do amplificador operacional se estendem de rail a rail da alimentação, permitindo a maximização da razão sinal-ruído.
Mais uma vez, para poder enviar várias medições de pH, realizadas através de uma matriz de microelétrodos, foi necessário implementar um multiplexer analógico, para que todas as medições possam ser enviadas para o PC. Desenhou-se então um multiplexer semelhante ao do circuito analógico, com 8 entradas e uma saída, implementado através de três linhas de controlo.
Para a validação dos componentes projetados no software S-Edit, procedeu-se à caraterização do amplificador operacional e à verificação do correto funcionamento dos dois componentes, montados da mesma forma que no circuito analógico.
Os testes efetuados ao sistema completo, que compreende a simulação da leitura de um elétrodo (através de uma resistência de valor extremamente elevado), um amplificador operacional com montagem não-inversora com ganho de 2,8 e um multiplexer que permite alternar entre as medições dos diferentes elétrodos de pH, permitiram concluir que o amplificador operacional implementado consegue ler o valor de tensão proveniente da
medição do elétrodo, o qual apresenta uma impedância elevadíssima. Além disso, simularam- se soluções cuja diferença do valor de pH é de 0,05, isto é, a diferença do potencial medido por cada um dos elétrodos é de, aproximadamente, 3mV, e verificou-se que o sistema é capaz de distinguir soluções com esta diferença do valor de pH (0,05).
Realizaram-se, ainda, testes ao sistema completo considerando variações na fonte de alimentação de ±10%, verificando-se que uma variação de +10% na tensão de alimentação não provocou alterações consideráveis na resposta do circuito. Contudo, uma variação de - 10% na tensão de alimentação causou ambiguidade na diferenciação de soluções que apresentam diferenças de 3mV entre si, ou seja, que diferem apenas em 0,05 unidades de pH, o que se deve a uma diminuição da gama da tensão de alimentação. O valor do consumo associado ao circuito completo implementado em S-Edit foi de 32,5mW.
Relativamente às principais dificuldades e limitações ao longo do desenvolvimento desta dissertação, a existência de apenas um elétrodo de pH disponível levou a que o sistema desenvolvido não pudesse ser testado com várias medições de pH a decorrer simultaneamente, como se de uma matriz de elétrodos se tratasse.
Relativamente às perspetivas de trabalho futuro, devem ser efetuados testes experimentais ao dispositivo desenvolvido utilizando uma amostra mais significativa, com mais soluções e realizando mais medições a cada uma delas.
Futuramente o sistema desenvolvido deve utilizar microeléctrodos de pH como mecanismo sensorial, tal como é objetivo deste trabalho, e não elétrodos de pH comerciais, devendo ser verificado o seu funcionamento com estes novos elétrodos.
Uma vez que o amplificador operacional e o multiplexer desenvolvidos no software S- Edit apenas foram testados em simulação devido ao seu fabrico não poder ser realizado no tempo útil desta dissertação, outra perspetiva de trabalho futuro consiste no fabrico destes componentes (tecnologia CMOS).
Finalmente, o dispositivo deve ser incorporado juntamente com outros sistemas complementares de análise que estão a ser desenvolvidos neste mesmo projeto, nomeadamente o sistema de espectroscopia, e deve ser testado em ambiente clínico, para a completa validação do dispositivo.
Bibliografia
[1] I. A. for R. on Cancer, “GLOBOCAN 2012: Estimated Cancer Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide in 2012,” 2012. [Online]. Available: http://globocan.iarc.fr/Default.aspx. [Accessed: 29-Jan-2014].
[2] “Displasia,” Dicionário Priberam da Língua Portuguesa. [Online]. Available: http://www.priberam.pt/DLPO/displasia. [Accessed: 25-Jul-2014].
[3] “Metastasis,” Science Daily. [Online]. Available: http://www.sciencedaily.com/articles/m/metastasis.htm. [Accessed: 25-Jul-2014].
[4] J. Wang, “Electrochemical biosensors: towards point-of-care cancer diagnostics.,” Biosens. Bioelectron., vol. 21, no. 10, pp. 1887–92, Apr. 2006.
[5] D. R. Thévenot, K. Toth, R. A. Durst, and G. S. Wilson, “Technical report Electrochemical biosensors : recommended definitions and classification,” Biosens. Bioelectron., vol. 16, pp. 121–131, 2001.
[6] M. Delvaux and Gérard Gay, “Capsule endoscopy in 2005: facts and perspectives.,” Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol., vol. 20, no. 1, pp. 23–39, Mar. 2006.
[7] “Biópsia,” Dicionário Priberam da Língua Portuguesa. [Online]. Available: http://www.priberam.pt/DLPO/biópsia. [Accessed: 25-Jul-2014].
[8] K. Geboes, X. Sagaert, and K. P. Geboes, “Dysplasia, Intraepithelial Neoplasia and Neoplasia without Dysplasia in the Digestive Tract,” Eur. Gastroenterol. Hepatol. Rev., vol. 7, no. 1, pp. 37–42, 2011.
[9] D. S. dos S. Ferreira, “Spectroscopy systems for the detection of gastrointestinal dysplasia,” Universidade do Minho, 2011.
[10] B. A. Webb, M. Chimenti, M. P. Jacobson, and D. L. Barber, “Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression.,” Nat. Rev. Cancer, vol. 11, no. 9, pp. 671–7, Sep. 2011.
[11] R. J. Baker, CMOS Circuit Design, Layout and Simulation, Third Edit. A John Wiley & Sons, Inc., Publication, 2010, pp. 378–380.
[12] J. Webster, Editor-in-Chief, N. F. Sheppard, and A. Guiseppi-Elie, “pH Measurement,” in The Measurement, Instrumentation and Sensors Handbook, Florida: CRC Press LLC, 2000.
[13] M. Yuqing, C. Jianrong, and F. Keming, “New technology for the detection of pH.,” J. Biochem. Biophys. Methods, vol. 63, no. 1, pp. 1–9, Apr. 2005.
[14] E. Iessi, M. L. Marino, F. Lozupone, S. Fais, and A. De Milito, “Tumor acidity and malignancy: novel aspects in the design of anti-tumor therapy (Review Article),” Cancer Ther., vol. 6, pp. 55–66, 2008.
[15] G. R. Martin and R. K. Jain, “Noninvasive Measurement of Interstitial pH Profiles in Normal and Neoplastic Tissue Using Fluorescence Ratio Imaging Microscopy,” Cancer Res., vol. 54, pp. 5670–5674, 1994.
[16] X. Zhang, Y. Lin, and R. J. Gillies, “Tumor pH and its measurement.,” J. Nucl. Med., vol. 51, no. 8, pp. 1167–70, Aug. 2010.
[17] I. F. Tannock and D. Rotin, “Acid pH in Tumors and Its Potential for Therapeutic Exploitation,” Cancer Res., vol. 49, no. 13, pp. 4373–4384, 1989.
[18] M. C. Brahimi-Horn, J. Chiche, and J. Pouysségur, “Hypoxia and cancer.,” J. Mol. Med., vol. 85, no. 12, pp. 1301–7, Dec. 2007.
[19] M. F. McCarty and J. Whitaker, “Manipulating Tumor Acidification as a Cancer Treatment Strategy,” Altern. Med. Rev., vol. 15, no. 3, pp. 264–272, 2010.
[20] L. Tian and Y. H. Bae, “Cancer nanomedicines targeting tumor extracellular pH.,” Colloids surfaces B Biointerfaces, vol. 99, pp. 116–26, Nov. 2012.
[21] P. Swietach, R. D. Vaughan-Jones, and A. L. Harris, “Regulation of tumor pH and the role of carbonic anhydrase 9.,” Cancer Metastasis Rev., vol. 26, no. 2, pp. 299–310, Jun. 2007.
[22] X.-F. Cheng and R.-H. Wu, “MR-Based Methods for pH Measurement in Brain Tumors: Current Status and Clinical Potential,” in Diagnostic Techniques and Surgical Management of Brain Tumors, 2011, pp. 287–302.
[23] P. . Patel, “(Bio)sensors for measurement of analytes implicated in food safety: a review,” Trends Anal. Chem., vol. 21, no. 2, pp. 96–115, Feb. 2002.
[24] D. D. Zhou, “Microelectrodes for in-vivo determination of pH,” in Electrochemical Sensors, Biosensors and Their Biomedical Applications, 1st Editio., vol. 22, no. 1, X. Zhang, H. Ju, and J. Wang, Eds. Academic Press, 2008, pp. 261–305.
[25] J. Hopkins, “Barrett’s Esophagus: Introduction,” Johns Hopkins Medicine. [Online]. Available:
http://www.hopkinsmedicine.org/healthlibrary/conditions/adult/digestive_disorders/b arretts_esophagus_22,BarrettsEsophagus/. [Accessed: 11-Sep-2014].
[26] P. Rizk and N. Barker, “Gut stem cells in tissue renewal and disease: methods, markers, and myths.,” Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med., vol. 4, no. 5, pp. 475– 96, 2012.
[27] J. Fallingborg, “Intraluminal pH of the human gastrointestinal tract,” Dan. Med. Bull., vol. 46, no. 3, pp. 183–96, 1999.
[28] S. G. Nugent, D. Kumar, D. S. Rampton, and D. F. Evans, “Intestinal luminal pH in inflammatory bowel disease: possible determinants and implications for therapy with aminosalicylates and other drugs.,” Gut, vol. 48, no. 4, pp. 571–7, Apr. 2001.
[29] H.-S. Wong and M. H. White, “A CMOS-Integrated ‘ISFET-Operational Amplifier’ Chemical Sensor Employing Differential Sensing,” IEEE Trans. Electron Devices, vol. 36, no. 3, pp. 479–487, 1989.
[30] T. C. W. Yeow, M. R. Haskard, D. E. Mulcahy, H. I. Seo, and D. H. Kwon, “A very large integrated pH-ISFET sensor array chip compatible with standard CMOS processes,” Sensors Actuators B Chem., vol. 44, no. 1–3, pp. 434–440, Oct. 1997.
[31] Y.-L. Chin, J.-C. Chou, T.-P. Sun, W.-Y. Chung, and S.-K. Hsiung, “A novel pH sensitive ISFET with on chip temperature sensing using CMOS standard process,” Sensors Actuators B Chem., vol. 76, no. 1–3, pp. 582–593, Jun. 2001.
[32] B. Lakard, G. Herlem, M. de Labachelerie, W. Daniau, G. Martin, J.-C. Jeannot, L. Robert, and B. Fahys, “Miniaturized pH biosensors based on electrochemically modified electrodes with biocompatible polymers,” Biosens. Bioelectron., vol. 19, no. 6, pp. 595–606, Jan. 2004.
[33] D. Grieshaber, R. MacKenzie, J. Voros, and E. Reimhult, “Electrochemical Biosensors - Sensor Principles and Architectures (Review Paper),” Sensors, vol. 8, pp. 1400–1458, 2008.
[34] “The pH Electrode Potential,” 2013. [Online]. Available: http://www.all-about- ph.com/electrode-potential.html. [Accessed: 09-Jan-2014].
[35] “HI 1330 Hanna Instruments.” [Online]. Available: http://www.hannacom.pt/produtos.ver.php?idProd=395. [Accessed: 14-Jul-2014].
[36] “HI 8424 Hanna Instruments.” [Online]. Available: http://www.hannacom.pt/produtos.ver.php?idProd=70. [Accessed: 19-Jul-2014].
[37] S. Kleiman, D. Shah, and B. Smaalders, Programming With Threads, 1st Editio. Upper Saddle River, NJ: Prentice Hall, 1996.
[38] R. Hogervorst, Design of Low-Voltage Low-Power CMOS Operational Amplifier Cells. Delft: Delft University Press, 1996.
[39] F. de Lacerda, “Projeto de um Amplificador Operacional CMOS de baixa tensão do tipo rail-to-rail,” Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Elétrica e de Computação, 2001.
Anexos
ANEXO I – Multiplexer Analógico
O multiplexer selecionado para a aplicação é o ADG608 da Analog Devices. Este comuta entre oito entradas, S1-S8, que constituem as entradas do próprio sinal, proveniente da matriz de elétrodos de pH, que são dirigidas para uma saída comum, D. VDD, VSS e GND são as alimentações do dispositivo. EN (enable) permite, de certa forma, ligar ou desligar este componente, uma vez que este só funciona se esta entrada tiver um valor de tensão associado. A0, A1, A2 encontram-se conectadas ao microcontrolador, de forma a controlar a comutação dos canais do multiplexer. O diagrama de pinos do MUX selecionado encontra-se representado na Figura AI.1 e a sua tabela de verdade na Tabela AI.1.
Figura AI.1 - Diagrama de pinos do multiplexer ADG608.
Tabela AI.1 - Tabela de verdade do multiplexer ADG608
A2 A1 A0 EN Ligado X X X 0 Nenhum 0 0 0 1 1 0 0 1 1 2 0 1 0 1 3 0 1 1 1 4 1 0 0 1 5 1 0 1 1 6 1 1 0 1 7 1 1 1 1 8
ANEXO II – Curva de Calibração Experimental
Na Tabela AII.1 encontram-se representados os valores de pH obtidos nas dez medições realizadas a cada uma das 26 soluções de teste.
Tabela AII.1 – Valores de pH obtidos com o dispositivo comercial, que consistem em 5 medições de pH a cada uma das 26 soluções Solução Medição de pH 1 2 3 4 5 1 3,44 3,45 3,41 3,43 3,42 2 3,67 3,65 3,66 3,66 3,65 3 3,80 3,82 3,82 3,80 3,81 4 3,92 3,93 3,93 3,92 3,93 5 3,97 4,00 3,96 3,97 3,97 6 5,24 5,22 5,25 5,25 5,24 7 5,26 5,27 5,28 5,26 5,24 8 5,34 5,35 5,35 5,34 5,35 9 5,48 5,46 5,47 5,47 5,48 10 5,49 5,54 5,53 5,52 5,53 11 5,57 5,58 5,57 5,56 5,58 12 5,61 5,62 5,60 5,63 5,63 13 5,73 5,71 5,70 5,70 5,71 14 5,78 5,78 5,79 5,80 5,76 15 5,80 5,82 5,83 5,81 5,79 16 5,93 5,93 5,94 5,95 5,92 17 6,00 5,98 6,01 6,03 6,03 18 5,99 6,03 6,02 6,03 6,02 19 6,05 6,08 6,02 6,05 6,06 20 6,25 6,23 6,26 6,25 6,25 21 6,24 6,28 6,28 6,27 6,27 22 6,55 6,56 6,55 6,55 6,56 23 6,71 6,68 6,70 6,73 6,72 24 6,78 6,77 6,78 6,79 6,78 25 7,01 7,02 7,00 7,05 7,03 26 7,09 7,07 7,08 7,10 7,12
ANEXO III – Resultados Experimentais
Na Tabela AIII.1 encontram-se representados os valores de pH obtidos nas dez medições realizadas a cada uma das 26 soluções de teste.
Tabela AIII.1 – Valores de pH obtidos nos testes experimentais realizados, que consistem em 10 medições de pH a cada uma das 26 soluções, com o dispositivo desenvolvido
Solução Medição de pH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 3,45 3,47 3,42 3,43 3,43 3,42 3,4 3,43 3,44 3,43 2 3,67 3,65 3,66 3,62 3,69 3,66 3,70 3,68 3,69 3,64 3 3,81 3,86 3,84 3,78 3,81 3,85 3,77 3,79 3,81 3,84 4 3,90 3,89 3,92 3,95 3,96 3,94 3,93 3,92 3,93 3,93 5 3,97 4,00 4,01 3,98 3,96 3,97 4,00 3,99 3,93 3,94 6 5,24 5,22 5,25 5,28 5,20 5,21 5,23 5,27 5,24 5,26 7 5,26 5,27 5,21 5,28 5,25 5,29 5,28 5,29 5,22 5,26 8 5,34 5,35 5,35 5,30 5,37 5,39 5,34 5,35 5,36 5,38 9 5,47 5,51 5,47 5,46 5,49 5,44 5,46 5,47 5,48 5,49 10 5,48 5,50 5,54 5,52 5,53 5,55 5,48 5,52 5,53 5,54 11 5,57 5,58 5,53 5,55 5,60 5,61 5,60 5,61 5,59 5,57 12 5,61 5,62 5,60 5,66 5,65 5,62 5,63 5,62 5,59 5,58 13 5,73 5,72 5,69 5,74 5,71 5,71 5,72 5,73 5,71 5,73 14 5,78 5,78 5,79 5,80 5,75 5,78 5,81 5,79 5,78 5,76 15 5,82 5,84 5,83 5,81 5,79 5,80 5,81 5,81 5,82 5,81 16 5,94 5,94 5,93 5,96 5,90 5,93 5,91 5,92 5,93 5,93 17 6,00 5,98 6,01 6,00 6,02 5,99 6,03 6,01 6,00 6,02 18 5,99 6,03 6,01 6,00 6,02 6,02 6,03 6,04 6,02 6,03 19 6,05 6,08 6,02 6,09 6,07 6,05 6,00 6,01 6,04 6,05 20 6,25 6,20 6,23 6,21 6,23 6,24 6,22 6,27 6,25 6,28 21 6,24 6,28 6,26 6,27 6,23 6,30 6,28 6,31 6,27 6,26 22 6,55 6,56 6,53 6,58 6,56 6,59 6,57 6,53 6,56 6,55 23 6,71 6,68 6,70 6,73 6,72 6,69 6,71 6,70 6,72 6,7 24 6,76 6,74 6,76 6,75 6,80 6,79 6,78 6,77 6,78 6,77 25 7,01 7,03 7,00 7,05 7,02 7,03 7,07 7,01 6,99 7,01 26 7,09 7,05 7,08 7,10 7,08 7,09 7,06 7,09 7,08 7,09