Oppfølging av pasienter i konservativ uremibehandling

5.1 - Avaliação citológica das células presentes em amostras recolhidas de material in vitro

A cultura de meristemas por si só é uma boa técnica para obtenção de plantas isentas de vírus. Devido à utilização do meristema como explante, não só é permitida a produção de plantas livres de vírus, como já referido no ponto 3, mas também permite a manutenção da identidade do genótipo regenerado, em virtude das células meristemáticas possuírem a tendência de se manterem geneticamente estáveis, característica de interesse na produção de clones. A associação da termoterapia ou quimioterapia com o cultivo in vitro auxilia na redução do “pool” de viroses (Júnior, 2011), diminuindo ainda mais os efeitos nefastos sobre a produtividade da cultura.

A indexagem de partículas virais para o ensaio 1 e 3 incidiu sobre amostras foliares de plantas regeneradas da cultivar 08010 obtidas em todos os tratamentos efectuados. Esta cultivar destacou-se logo pelo maior peso médio dos dentes de alho, e que, segundo Verbeek et al. (1995) é um bom indício para se conseguir uma mais eficiente eliminação de partículas virais. No entanto, pelo grande tamanho do meristema, o estabelecimento desta cultivar em cultura in vitro previa-se difícil pelas contaminações que poderiam surgir. Esta cultivar revelou uma baixa regeneração, contudo, com o tratamento térmico mais drástico (45 °C) ou com RBV, a eficiência de regeneração aumentou e quando o tratamento térmico foi aplicado sobre o meristema, esta cultivar apresentou uma maior resistência aos potenciais efeitos nefastos do tratamento que as restantes cultivares. O bom desenvolvimento vegetativo desta cultivar em cultura in vitro é um indício para que esta cultivar esteja isenta de partículas virais.

Além da cultura de meristemas, também a cultura de discos basais é uma boa técnica para a obtenção de plantas livres de vírus. Para avaliar a eliminação de partículas virais através da cultura de discos basais, ensaio 2, utilizou-se a cultivar 07817. Esta cultivar apresentou a melhor taxa de multiplicação com este tipo de cultura de tecidos.

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5.1.1 – Ensaio 1

Sobre o microscópio electrónico de transmissão, as imagens revelaram que na ausência de qualquer tipo de tratamento (T25), os cloroplastos apresentavam uma maior concentração de grãos de amido (Fig. 21 A), tendo-se ainda observado invaginações da parede celular (Fig. 21 B) que originariam vesículas. Estes factos indicam uma possível contaminação viral por parte dos Potyvirus e Carlavirus.

Ga A

B

Figura 21: Microscopia electrónica de secções ultra-finas do mesófilo de células de

folhas de Allium sativum não sujeitas a qualquer tratamento (T25). A -

Cloroplastos em célula infectada com concentração de grãos de amido. Ga: Grão de amido; B - Invaginação da parede celular.

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Com a aplicação da RBV (T25R), mesmo a concentrações que se revelaram nefastas para o desenvolvimento da planta, verificou-se que os cloroplastos dispostos na célula normalmente (Fig. 22 B), apresentavam uma diminuição de grãos de amido presentes nos cloroplastos (Fig. 22 A), apoiando a hipótese de que a acção da RBV possa ter contribuído para a diminuição do “pool” de viroses.

A

B

Figura 22: Microscopia electrónica de secções ultra-finas do mesófilo de células de folhas de A. sativum sujeitas apenas à quimioterapia (T25R). A - Cloroplasto em célula não infectada; B - Visão geral da disposição dos cloroplastos da célula não infectada.

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Já com o tratamento térmico a 37 °C (T37), observou-se uma acumulação de gotas lipídicas no cloroplasto (Fig. 23 A), facto comprovativo de que a célula se encontrava infectada. Quando se associou a termoterapia a 37 °C com a RBV (T37R) observou-se uma concentração de grãos de amido no cloroplasto anormal (Fig. 23 B). Com isto, apesar de se verificar uma condensação lipídica fora do cloroplasto (Fig. 23 B), pode concluir-se que a acção da RBV foi inibida quando se associou a temperaturas de 37 °C, permanecendo a célula infectada pelas partículas virais.

A

B

Gt Lip

Lip Ga

Figura 23: Microscopia electrónica de secções ultra-finas do mesófilo de células

de folhas A. sativum: A - Cloroplastos em célula infectada com concentração de

gotas lipídicas (T37). Gt Lip: Gotas lipídicas; B - Cloroplastos em célula infectada com concentração de grãos de amido (T37R). Ga: Grão de amido; Lip: condensação de gota lipídica fora do cloroplasto.

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No tratamento térmico mais drástico (45 ⁰C, T45), observaram-se inclusões cristalinas na amostra da folha (Fig. 24 A). Estas inclusões no citoplasma são características dos Potyvirus. No entanto, quando se associa a termoterapia a 45 ⁰C com RBV (T45R), foi notório a ausência dessas inclusões cristalinas no citoplasma (Fig. 24 B). Assim, pressupõem-se que, ao contrário da associação da temperatura a 37 ⁰C com RBV, esta associação permitiu a eliminação de vírus pertencentes ao género Potyvirus.

CI

CI A

B

Figura 24: Microscopia electrónica de secções ultra-finas do mesófilo de células de

folhas de A. sativum: A - Visão geral do citoplasma com inclusões cristalinas (CI)

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5.1.2 - Ensaio 3

Como verificado já anteriormente, na ausência de qualquer tipo de tratamento (T25), observaram-se indícios da presença de partículas virais pertencentes aos géneros Potyvirus e Carlavirus (Fig. 21 A e B). No entanto, com a aplicação da RBV (T25R), surge a hipótese de que este antiviral possa ter contribuído para a diminuição do “pool” de viroses. Quando a aplicação da termoterapia a 37 ⁰C é sobre o meristema (após a sua introdução no meio de cultura) também não se observaram indícios que comprovassem a presença de partículas virais pertencentes aos géneros Potyvirus e Carlavirus, mas observaram-se partículas virais pertencentes ao género Tospovirus, a espécie TSWV. Isto verificou-se tanto na ausência de RBV (Fig. 25 A) como na presença do antiviral (Fig. 25 B).

TSWV A

TSWV B

Figura 25: Microscopia electrónica de secções ultra-finas do

mesófilo de células de folhas de A. sativum: A - TSWV em amostras

foliares submetidas a um tratamento térmico a 37 ºC; B - TSWV em

amostras foliares submetidas a um tratamento térmico a 37 ºC associado à utilização de RBV.

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5.1.3 - Ensaio 2

A cultura de discos basais para a cultivar 07817, tal como a cultura de meristemas, não proporcionaram a observação de indícios que comprovassem a presença de vírus pertencentes aos géneros Carlavirus e Potyvirus. No entanto, tanto esta cultura de tecidos (Fig. 26 B) como a cultura de meristemas (Fig. 26 A) apresentaram partículas virais da espécie TSWV. Consideradas técnicas que permitiram um bom número de plantas regeneradas livres de vírus, não permitiram contudo a eliminação desta espécie de vírus, pelo menos para esta cultivar.

Figura 26: Microscopia electrónica de secções ultra-finas do mesófilo de células

de folhas de A. sativum: A - TSWV em amostras foliares provenientes da cultura

de meristemas; B - TSWV em amostras foliares provenientes da cultura de discos

basais.

TSWV A

TSWV B

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No entanto, na associação da cultura de discos basais a temperaturas de 37 ou 45 ⁰C não se identificaram quaisquer partículas virais ou alterações citológicas. Na associação da cultura de disco basais com temperaturas de 37 ⁰C, os cloroplastos apresentaram-se normais (Fig. 27 A), assim como no tratamento a 45 ⁰C também se demonstraram (Fig. 27 C), para além de também apresentarem uma disposição considerada normal na célula (Fig. 27 B). Surge assim a hipótese de que a associação deste tipo de cultura de tecido associado à termoterapia poderá ser eficaz na eliminação das partículas virais presentes em A. sativum.

A

B C

Figura 27: Microscopia electrónica de secções ultra-finas do mesófilo de células de folhas de A. sativum: A -

Cloroplastos normais sem concentração de grãos de amido ou gotas lipídicas resultantes de um tratamento térmico a 37 ⁰C associado à cultura de discos basais; B - Visão geral da disposição dos cloroplastos da célula não infectada lipídicas resultantes de um tratamento térmico a 45 ⁰C associado à cultura de discos basais; C - Cloroplastos normais sem concentração de grãos de amido ou gotas lipídicas resultantes de um tratamento térmico a 45 ⁰C associado à cultura de discos basais.

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