Oppbygging av ledninger

Conclusões 166

5. CONCLUSÕES

O trabalho desenvolvido envolveu a preparação dos blocos de construção βGlcNAc-Thr 22, αGlcNAc-Thr 23, βGal-Thr 28, βLacNAc-Thr 53 e αLacNAc-Thr 41, e dos glicopeptídeos β-D-GlcNAc-(Thr)6-GlyOH 43, β-D-Gal-(Thr)6GlyOH 45, NH2(Thr)2-

(βGlcNAc)-(Thr)3-GlyOH 1, α-D-GlcNAc-(Thr)5-Thr[β-D-GlcNAc]-GlyOH 48, β-D-Gal-Thr-

Thr[β-D-Gal]-Thr-Thr[β-D-Gal]-Thr-ThrGlyOH 50, NH2(Thr)2-(βLacNAc)-(Thr)3-GlyOH 4,

NH2(Thr)2-(αLacNAc)-(Thr)3-GlyOH 2 e NH2(Thr)2-(βLacNAc)-(Thr)3-(αLacNAc)-(Thr)3-

GlyOH 5, potenciais substratos das enzimas β1,4-GalT e TcTS.

A reação de glicosilação empregando o doador glicosídico αGlcNAcCl 12 e o aminoácido FmocThrOBn 18, na presença do catalisador HgBr2, representou a melhor

alternativa para a obtenção dos isômeros βGlcNAc-ThrOBn 17 e αGlcNAc-ThrOBn 19, obtidos com rendimentos de 52% e 20%, respectivamente (total 72%). As reações de hidrogenólise para remoção dos grupos éster O-benzílicos e amino de 17 e 19 foram conduzidas com sucesso, sendo obtidos os produtos 24 e 25 com rendimentos em torno de 90%. A reação de desacetilação destes produtos resultou na formação dos compostos βGlcNAc-Thr 22 (90%) e αGlcNAc-Thr 23 (88%), totalmente desprotegidos.

O bloco βGal-FmocThrOBn 26 foi obtido com rendimento de 28% por meio de reações de glicosilação dos doadores glicosídicos βGalBr 13 e βGalOCCl3CN 15 com o aminoácido

FmocThrOBn 18, utilizando os promotores iodo e TMSOTf, respectivamente. As reações de hidrogenólise e desacetilação do produto obtido 26 conduziram à obtenção do bloco βGal- ThrOH 28 totalmente desprotegido em alto rendimento (86%).

A abordagem envolvendo a síntese química total dos dissacarídeos glicosídicos αLacN3-

FmocThrOBn 39 e βLacN3-FmocThrOBn 72, para o posterior acoplamento em cadeia

peptídica e ensaio enzimático com a enzima TcTS, foi satisfatória apenas para a obtenção do composto alfa 39. As reações de glicosilação entre os doadores glicosídicos cloreto de 3,6-di-

O-acetil-4-O-(2,3,4,6-tetra-O-acetil-β-D-galactopiranosil)-2-azido-2-deoxi-α-D-

glicopiranosila 33 e tricloroacetimidato de 3,6-di-O-acetil-4-O-(2,3,4,6-tetra-O-acetil-β-D- galacto-piranosil)-2-azido-2-deoxi-α-D-glucopiranosila 29 com o aminoácido FmocThrOBn

18, utilizando HgBr2 como catalisador, forneceram o composto 39 com rendimentos de 60 e

15%, respectivamente. A acetilação redutiva do grupo azido de 39 foi realizada de forma tradicional, sendo isolado o derivado acetamido 40 (65%). A completa desproteção de 40 foi realizada por meio de reações de hidrogenólise e desacetilação, sendo obtido o produto 41

com 70% de rendimento. O correspondente anômero beta 53 foi preparado por via químico- enzimática, empregando-se a enzima β1,4-GalT a partir do bloco βGlcNAc-Thr 22 totalmente desprotegido. Novas metodologias para a síntese química do dissacarídeo glicosídico βLacNAc-ThrOH 73 também foram investigadas, envolvendo reações de glicosilação em microondas do doador βLacNAcSAc 38, contendo grupo participante 2-N-acetil, bem como o seu correspondente derivado oxazolina 74, com o aminoácido 18 como aceptor. No entanto, não conduziram à formação do produto 73.

A investigação da reatividade da enzima β1,4-GalT frente à transferência de resíduo de galactose foi realizada paralelamente com os aminoácidos glicosilados 22 e 23 para obtenção dos dissacarídeos glicosídicos βLacNAc-Thr 53 e αLacNAc-Thr 41. A transferência total de galactose foi observada para o isômero beta em 24 h, enquanto para o alfa foram necessárias 96 h na presença de uma concentração quatro vezes maior de enzima. A interpretação destes resultados foi bastante dificultada devido aos problemas de purificação final. Após investigação de inúmeros métodos cromatográficos, o emprego da coluna Toyopearl HW-40S de filtração em gel foi o único procedimento que possibilitou o isolamento dos produtos 53 e 41 na forma pura com rendimentos de 85% e 57%, respectivamente.

Na etapa do trabalho referente à síntese de glicopeptídeos em fase sólida, foi possível a obtenção dos glicopeptídeos 42, 44, 46, 47, 49, 51 e 52 com rendimentos entre 40% e 70%, sendo que os valores mais baixos foram verificados para os glicopeptídeos 49 (42%) e 52 (40%) devido à maior complexidade e dificuldade de síntese dos mesmos. Os glicopeptídeos obtidos foram então submetidos à reação de desacetilação e purificados por CLAE, utilizando coluna de fase reversa semi-preparativa, sendo obtidos os respectivos glicopeptídeos desacetilados 43, 45, 1, 48, 50, 2 e 3 com rendimentos de 29%, 28,5%, 14%, 25%, 21%, 22% e 20%.

O uso da enzima β1,4-GalT permitiu também a preparação dos glicopeptídeos NH2(Thr)2-(βLacNAc)-(Thr)3-GlyOH 4 e NH2(Thr)2-(βLacNAc)-(Thr)3-(αLacNAc)-(Thr)3-

GlyOH 5 pela galactosilação do resíduo de βGlcNAc-Thr presente nos correspondentes glicopeptídeos preparados em síntese em fase sólida, 1 e 3. O método de purificação mais conveniente envolveu a utilização da coluna Toyopearl HW-40S de filtração em gel.

O estudo da estereosseletividade da reação com a enzima TcTS foi inicialmente explorada com os dissacarídeos 41 e 53, preparados por síntese total ou químico-enzimática. Os experimentos realizados empregando fetuína como substrato doador de ácido siálico demonstraram que a reação de sialilação ocorre igualmente com ambos anômeros α e β,

Conclusões 168

fornecendo rendimentos em torno de 90% (Neu5Acα(2-3)-αLacNAc-Thr 61 92% e Neu5Acα(2-3)-βLacNAc-Thr 62 90%). Este resultado foi considerado inesperado, tendo em vista que a configuração da posição anomérica da unidade de açúcar GlcNAc da molécula de mucina GPI do parasita é exclusivamente alfa (PREVIATO et al., 1995), o que parecia ser um requisito essencial para captação de ácido siálico promovido pela enzima TcTS. Resultados similares de reatividade foram também obtidos nas reações empregando-se os glicopeptídeos 2 (com bloco dissacarídeo α ligado à cadeia peptídica) e 4 (com bloco dissacarídeo β ligado ao peptídeo), os quais apresentaram-se como potenciais substratos aceptores da enzima trans- sialidase de Trypanosoma cruzi na presença de fetuína. Os compostos 2 e 4 forneceram os correspondentes glicopeptídeos sialilados: NH2(Thr)2-(Neu5Acα(2-3)-αLacNAc)-(Thr)3-

GlyOH 7 (85%) e NH2(Thr)2-(Neu5Acα(2-3)-βLacNAc)-(Thr)3-GlyOH 6 (82%).

Independente da presença da cadeia peptídica rica em aminoácidos de treonina, a sialilação realizada pela enzima TcTS ocorreu em ambos os isômeros, conforme análise após purificação por filtração em gel, assim como observado para os modelos 41 e 53. A reação de sialilação também realizada com o bloco βGal-ThrOH 28 forneceu o derivado sialilado Neu5Acα(2-3)-βGal-ThrOH 63 (50%), comprovando que a ponte de GlcNAc entre a unidade de galactose e o aminoácido treonina não é essencial para a atividade enzimática. Todos os resultados foram adequadamente confirmados por análises RMN de 1H e ESI-MS.

Os aminoácidos glicosilados 22, 23 e 28, os dissacarídeos glicosídicos 53 e 41 e as dicetopiperazinas glicosiladas ciclo-(βGlcNAc-L-Ser-D-Phe) 59 e ciclo-(αGlcNAc-L-Ser-D- Phe) 60 sintetizados foram submetidos a ensaios biológicos relacionados às atividades tripanocida, antitumoral e de inibição das enzimas fosfoquinases PKG, PKA e PKC. Em relação aos ensaios de atividade tripanocida, foram verificadas maiores taxas de lise parasitária para o açúcar GlcNAcCl 12 (80%) e para o bloco de construção βGal-ThrOH 28 (81%), na concentração de 32 µg/mL. Os ensaios de atividade antitumoral envolvendo os aminoácidos glicosilados βGlcNAc-ThrOH 22 e αGlcNAc-ThrOH 23 apresentaram maior citotoxicidade frente às células de leucemia T humana JURKART, com valores respectivos de 100% e 71,4% para os blocos 22 e 23, na concentração de 1 mg/ mL. Já as dicetopiperazinas glicosiladas 59 e 60 demonstraram maior potencialidade citotóxica frente à linhagem HCT-8, com valores de inibição de crescimento celular de 65,7% e 41,8%, respectivamente. Nos ensaios farmacológicos de inibição das enzimas fosfoquinases PKG, PKA e PKC, realizados com o aminoácido glicosilado 22, foi constatada pequena redução de atividade de PKC na presença de 22, não sendo verificada nenhuma inibição de PKG e PKA.

Os estudos de modelagem molecular realizados conduziram à obtenção de um padrão farmacofórico preliminar de inibidores de trans-sialidases, sendo também realizados cálculos de campos de interação molecular (MIFs) para a determinação da habilidade do sítio ligante de TcTS em interagir com inibidores. Estes resultados serão fundamentais para buscas em bases de dados de compostos contendo propriedades de fármacos, com o objetivo de se propor novos protótipos. Finalmente, estudos de simulações de docking dos compostos sintetizados 41, 53, 2, 4 e 28 com o sítio ativo da enzima TcTS foram realizados. Uma superposição estrutural dos compostos 41, 53, 2, 4 e 28 com a molécula aceptora de lactose foi verificada, sendo mantidas para todos eles as interações por ligação de hidrogênio entre as hidroxilas 3- OH e 4-OH da unidade de galactose com o aminoácido Asp59. Além do mais, interações adicionais importantes, inexistentes no complexo lactose-TcTS, foram estabelecidas entre grupos específicos destes compostos com determinados resíduos do sítio ativo de TcTS, como Arg311, Arg35, Asn60 e Ser122. Os resultados de docking indicaram a unidade de galactose destas moléculas como um requisito essencial para a atividade de trans-glicosilação, além de sugerirem possíveis modificações moleculares a serem introduzidas nestas estruturas explorando interações com os sítios aceptor e doador de TcTS.