Omfang

Afin d’évaluer les propriétés de reconnaissance du MIP-S1P 1 pour la S1P, deux tests de liaison tels que présentés dans la partie II.4 de Matériels et méthodes ont été réalisés.

Les mesures ont été effectuées par Chromatographie en phase Liquide couplée à la Spectrométrie de Masse (LC-MS) en utilisant la S1P en tant que molécule cible à une

Polymère Molécule

Template

Monomères fonctionnels

Agent

réticulant Initiateur Solvant

MIP-S1P 1 S1P (0,013 mmol) AB acétate (0,013 mmol) EDMA (0,26 mmol) ABDV (0,0053 mmol) Méthanol (900 µL) Chloroforme (130 µL) Triéthylamine (90 µL)

concentration de 700 nM dans le méthanol et également par spectroscopie de fluorescence (Varioskan® Flash) en utilisant la S1P fluorescéine en tant que molécule cible à une concentration de 5000 nM dans le méthanol. Ces concentrations d’incubation ont été déterminées en fonction des courbes de calibration et de la limite de quantification dans le méthanol des deux méthodes de mesure (voir Matériels et Méthodes).

Théoriquement, comme le MIP-S1P 1 a été synthétisé avec la S1P en tant que molécule

template, ses empreintes moléculaires devraient être uniquement complémentaire de la S1P

et non de la S1P fluorescéine. Néanmoins, nous avons fait le choix d’employer la S1P fluorescéine comme molécule cible de substitution de la S1P pour deux raisons principales. Premièrement, malgré ses différences de poids moléculaire (double de celui de la S1P), de taille et de structure (voir figure 2.12)attribuées à la présence du groupement fluorescéine, nous avons fait l’hypothèse qu’elle pourrait être reconnue par le MIP-S1P 1. En effet, le groupement fluorescéine est greffé en bout de chaine carbonée et pourrait ne pas perturber les interactions entre le monomère fonctionnel AB acétate et le groupe phosphate de la S1P fluorescéine. De plus, il est probable que la S1P fluorescéine soit capable de diffuser à travers la porosité micrométrique du MIP et de se lier, au moins en partie à certains sites de reconnaissance bien exposés, sans pour autant que la reconnaissance de forme et de taille soit totale. Il est possible dans ce dernier cas, que la capacité de liaison du MIP-S1P 1 pour la S1P fluorescéine soit réduite par rapport à celle pour la S1P.

Figure 2.12 : Structures de la S1P (a) et de la S1P fluorescéine (b).

Deuxièmement, l’utilisation de la S1P fluorescéine en tant que molécule cible nous a permis de mener des tests de liaison par spectroscopie de fluorescence qui sont beaucoup plus simple et rapide à mettre en œuvre que ceux réalisé en LC-MS.

Pour les tests de liaison, les molécules cibles ont été exposées à des concentrations variables de MIP-S1P 1 (de 0 à 3 mg/mL pour la S1P et de 0 à 4 mg/mL pour la S1P fluorescéine). Il est souvent recommandé de réaliser le test de liaison dans le même solvant que celui utilisé lors de la polymérisation afin de favoriser la réapparition des mêmes interactions [122]. Dans notre cas, ils ont été réalisés dans le méthanol seul. Il s’agit d’un solvant polaire qui favorise

les interactions électrostatiques, il est donc parfaitement adapté dans le cadre de l’utilisation du monomère AB acétate [111]. Les résultats des deux tests de liaison sont présentés dans la figure 2.13 a et b.

Figure 2.13 : Tests de liaison du MIP-S1P 1 pour la S1P (a) et pour la S1P fluorescéine dans le méthanol (b) (N=2).

Nous pouvons voir que les pourcentages de liaison de la S1P et de la S1P fluorescéine au MIP- S1P 1 augmentent avec la concentration de MIP-S1P 1 jusqu’à atteindre un palier correspondant à un pourcentage de liaison d’environ 65 % pour la S1P et 70 % pour la S1P fluorescéine. Le palier est atteint pour une concentration de MIP-S1P 1 de l’ordre de 1,5 mg/mL pour la S1P et de 1 mg/mL pour la S1P fluorescéine.

Nous observons également une légère diminution du pourcentage de liaison de la S1P pour la concentration du MIP-S1P 1 égale à 3 mg/mL.

Il est intéressant de constater que la liaison de S1P fluorescéine au MIP-S1P 1 est similaire à celle de S1P, malgré les différences structurelles déjà évoquées. La légère différence entre les pourcentages de liaison maximale ne semble pas significative compte tenu des barres d’erreurs. Si les liaisons observées sont bien dues à des interactions spécifiques ce résultat pourrait confirmer notre première hypothèse concernant la liaison possible de la S1P fluorescéine au MIP-S1P 1.

La différence de concentration de MIP-S1P 1 pour laquelle le palier est atteint pourrait s’expliquer par le fait que la concentration de S1P fluorescéine (5000 nM) était plus de sept fois supérieure à celle de S1P (700 nM). Pour une même concentration de MIP-S1P 1, la présence d’un nombre plus important de molécule cible en solution aurait pu augmenter les chances d’interaction avec les monomères fonctionnels et donc le pourcentage de liaison. Si on considère que la diminution du pourcentage de liaison de la S1P pour une concentration de MIP-S1P 1 égale à 3 mg/mL est significative on peut imaginer qu’elle puisse être causée par le problème de « bleeding » décrit dans le chapitre 1. Il est en effet possible que de la S1P mal extraite, piégée dans le MIP au moment de sa synthèse ait été relarguée en solution au cours du test de liaison. Cela aurait pu avoir pour conséquence une augmentation de la valeur de concentration de S1P dans le tube du test de liaison qui ce serait traduite par une diminution apparent du pourcentage de liaison. Ce phénomène est d’autant plus important que la concentration de polymère est élevée, une grande concentration de MIP ayant plus de chance de contenir une plus grande concentration de S1P mal extraite. Un autre avantage de l’utilisation de la S1P fluorescéine est que les effets du problème de « bleeding » ne sont pas directement observés puisque les concentrations de S1P non fluorescente ne sont pas quantifiées.