2. Teori
2.4 Om utviklingsarbeid
Frente à L-cisteína, o mesmo comportamento é observado para os nitrosilocomplexos (Figuras 116 e 117) e para o complexo cis-[RuCl2(phen)2] (Figura
118) em pH = 4,7. Sendo assim, a proposta feita para a reatividade com GSH é válida para a reatividade com L-cisteína. Todavia, as reações com este aminoácido foram bem mais rápidas que com GSH: ao passo que as medidas com este aminoácido foram realizadas em 1,5 h, as com GSH foram em 10 h. Essa diferença de tempo para alcançar o mesmo perfil espectral pode ser atribuída ao fato de L- cisteína ser uma molécula menor que GSH (Figura 4), o que facilitaria o ataque nucleofílico seja ao grupo nitrosil (nos nitrosilocomplexos), seja ao átomo de carbono da tiocarbonila (nos nitrosilo e nos clorocomplexos – Figuras 119 e 120), seja ao Ru(II) (no complexo precursor cis-[RuCl2(phen)2]). No experimento com FOR0212 e
443 para 420 nm (Figuras 119 e 120), respectivamente. Sendo assim, as alterações são semelhantes às observadas frente a GSH, nas mesmas condições.
Figura 116 - Alteração espectral do complexo FOR0912 (50 mol L-1) frente a L-cisteína a 37˚C em
solução de NaTFA 0,1 mol L-1, pH = 4,7, por 1,5 h, na razão L-cisteína/complexo = 30.
300 400 500 600 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Abso rb â n ci a Comprimento de onda (nm) 388 423 455 Fonte: o autor.
Figura 117 - Alteração espectral do complexo FOR0912A (50 mol L-1) frente a L-cisteína a 37˚C em
solução de NaTFA 0,1 mol L-1, pH = 4,7, por 1,5 h, na razão L-cisteína/complexo = 30.
300 400 500 600 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Abso rb â n ci a Comprimento de onda (nm) 388 420 448 Fonte: o autor.
Figura 118 - Alteração espectral do complexo cis-[RuCl2(phen)2] (50 mol L-1), frente a L-cisteína a
37˚C em solução de NaTFA 0,1 mol L-1, pH = 4,7, por 1,5 h, na razão L-cisteína/complexo = 1.
350 400 450 500 550 600 650 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 Abso rb â n ci a Comprimento de onda (nm) 420 389 Fonte: o autor.
Figura 119 - Alteração espectral do complexo FOR0212 (50 mol L-1) frente a L-cisteína a 37˚C em
solução de NaTFA 0,1 mol L-1, pH = 4,7, por 1,5 h, na razão L-cisteína/complexo = 30.
300 400 500 600 700 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Abso rb â n ci a Comprimento de onda (nm) 444 421 Fonte: o autor.
Figura 120 - Alteração espectral do complexo FOR0212A (50 mol L-1) frente a L-cisteína a 37˚C em
solução de NaTFA 0,1 mol L-1, pH = 4,7, na razão L-cisteína/complexo = 30.
300 400 500 600 700 0,0 0,2 0,4 0,6 Abso rb â n ci a Comprimento de onda (nm) 443 420 Fonte: o autor. 5.2.2 Fotorreatividade
A reatividade dos nitrosilocomplexos foi avaliada frente à luz azul e é ilustrada nas Figuras 121 e 122. Nota-se que com o tempo surgem duas bandas: uma em torno de 390 nm e outra em torno de 420 nm.
De acordo com Ford, Rose, Lopes e seus colaboradores23, 87, 91, 102,
complexos que contêm o grupo nitrosil produzem óxido nítrico sob efeito fotoquímico. Especificamente para estes complexos, como já foi discutido, há um ombro em torno de 450 nm, cuja transição eletrônica é do tipo *NO (L), em L = phen ou TBz para os compostos FOR0912 e FOR0912A, respectivamente. Visto que a fonte de irradiação é de 450 nm, infere-se que há formação do complexo com NO coordenado e o ligante oxidado. Uma vez que a reação ocorre em meio aquoso, há possibilidade de substituição da água pelo óxido nítrico, tal qual acontece com outros nitrosilocompostos.
Esta proposta também é alicerçada na comparação dos espectros dos compostos FOR0212 e FOR0212A (Figura 123). Isso porque estes, nas mesmas condições, possuem máximo de absorção em 451 e 443 nm, respectivamente, e, como já foi explicado a molécula de água é um ligante mais forte que cloreto, o que contribui para haver deslocamento da banda para região de maior energia.
Figura 121 - Monitoramento da variação espectral do complexo FOR0912 em solução 2%(v/v) MeCN NaTFA pH 4,7 frente a luz azul ( =450 nm) por 180 min.
300 400 500 600 700 0,0 0,4 0,8 Abso rb â n ci a Comprimento de onda (nm) 392 420 Fonte: o autor.
Figura 122 - Monitoramento da variação espectral do complexo FOR0912A em solução 2%(v/v) MeCN NaTFA pH 4,7 frente a luz azul ( =450 nm) por 180 min.
300 400 500 600 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 Abso rb â n ci a Comprimento de onda (nm) 423 384 Fonte: o autor.
Adicionalmente, como também já foi explicado tanto, o-fenantrolina, quanto tiobenzamida, atual como -receptores frente a Ru(II). Então, uma vez oxidados, devido à perda do elétron, a capacidade -receptora destes tende a aumentar, o que contribuiria também para um aumento da energia da banda e
decréscimo do comprimento de onda da banda TCML. Esses fatores sustentam a proposta de geração do aquocomplexo com o ligante oxidado, já que nos espectros após irradiação (Figuras 121 e 122) surgem uma banda em torno de 420 nm, comprimento de onda menor que os das bandas TCML dos clorocomplexos (Figura 123). Logo, a partir desses resultados, sugere-se a fotoliberação de óxido nítrico.
Figura 123 - Espectros, nas regiões do UV-Vis, dos compostos FOR0212 (preto) e FOR0212A (vermelho) em solução 2%(v/v) MeCN NaTFA pH 4,7.
300 400 500 600 700 0.0 0.2 0.4 Abso rb â n ci a Comprimento de onda (nm) Fonte: o autor. 5.2.3 Fotoliberação
Com o intuito de obter um indício mais consistente de liberação de óxido nítrico, efetuou-se o ensaio com um reagente seletivo (scavenger) para NO e HNO: 2-(4-Carboxifenil)-4,4,5,5-tetrametilimidazol-1-oxi-3-óxido, simbolizado por cPTIO (Figura 124).
Figura 124 - Estrutura do cPTIO, um supressor de NO/HNO.
Fonte: o autor.
De acordo com Uri Samuni, Bobko e colaboradores103, 104, cPTIO possui
esperado o decréscimo da intensidade dessas bandas: no caso da reação com NO há também formação de uma banda em torno de 440 nm, característica do cPTI (Figura 125); se cPTIO reage com HNO não há formação de bandas acima de 400 nm, característico do cPTI-H (Figura 126).
Figura 125 - Estrutura do cPTI, produto da reação entre cPTIO e NO.
Fonte: o autor.
Figura 126 - Estrutura do cPTI-H, produto da reação entre cPTIO e HNO.
Fonte: o autor.
O comportamento dos complexos FOR0912 e FOR0912A em presença de cPTIO, após irradiação com LED azul ( = 450 nm) (Figuras 127 e 128, respectivamente) ilustra que há diminuição da intensidade das bandas em 360 e 560 nm, ao passo que surge uma banda em torno de 440 nm. Com base no que foi informado anteriormente, este dado é propositivo de reação entre cPTIO e óxido nítrico. Assim, pode-se deduzir que ambos os nitrosilocomplexos são doadores de óxido nítrico, o que reforça a potencialidade de aplicação destes compostos como vasodilatador.
A proposta de fotoliberação de óxido nítrico é respaldada também pelos dados computacionais obtidos por DFT, segundo os quais as transições eletrônicas em 450 nm – mesmo comprimento de onda do Led usado experimentalmente – envolvem transferência de carga de o-fenantrolina (FOR0912) ou tiobenzamida (FOR0912A) para o grupo nitrosil (em ambos complexos), como pode ser visto nas Tabelas 12 e 13.
Com base também nos cálculos computacionais, foi possível determinar a diferença de energia entre os orbitais envolvidos na transição eletrônica, em 450 nm, para FOR0912 e FOR0912A: 3,24 e 3,15 eV, respectivamente. Esses valores estão
em conformidade com o tempo de aparecimento da banda em 440 nm ser maior para o complexo FOR0912 (45 min) que para o complexo FOR0912A (30 min).
Figura 127 - Monitoramento do perfil espectral do complexo FOR0912 (25 mol L-1) por 3h em
presença de cPTIO (150 mol L-1), a 25˚C, em diferentes tempos de irradiação com LED azul.
300 400 500 600 700 800 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Abso rb â n ci a Comprimento de onda (nm) 360 560 440 Fonte: o autor.
Figura 128 - Monitoramento do perfil espectral do complexo FOR0912A (25 mol L-1) por 3h em
presença de cPTIO (150 mol L-1), a 25˚C, em diferentes tempos de irradiação com LED azul.
300 400 500 600 700 800 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Abso rb â n ci a Comprimento de onda (nm) 360 440 560 Fonte: o autor.
Cabe também frisar que, para investigar se a liberação de óxido nítrico só ocorria sob fotoindução, foi feito o ensaio nas mesmas condições citadas
anteriormente, contudo na ausência de luz (Figuras 129 e 130). Pôde-se notar que a alteração de absorbância em 360 e 560 nm são insignificantes e não há formação de banda em 440 nm. Posto isso, conclui-se que a liberação de óxido nítrico para este composto, nessas condições, só ocorre sob fotoindução.
Figura 129 - Monitoramento do perfil espectral do complexo FOR0912 (25 mol L-1) por 3h em
presença de cPTIO (150 mol L-1), a 25˚C, na ausência de luz.
300 400 500 600 700 800 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 Abso rb â n ci a Comprimento de onda (nm) Fonte: o autor.
Figura 130 - Monitoramento do perfil espectral do complexo FOR0912A (25 mol L-1) por 3h em
presença de cPTIO (150 mol L-1), a 25˚C, na ausência de luz.
300 400 500 600 700 800 0.0 0.2 0.4 0.6 Abso rb â n ci a Comprimento de onda (nm) Fonte: o autor.
5.3 Dados biológicos
5.3.1 Ensaio de clivagem do DNA
As Figuras 131 e 132 ilustram o comportamento, após eletroforese no gel de agarose, dos complexos em diferentes concentrações, frente ao DNA plasmídico pBR 322, na ausência de luz e após irradiação de luz (LED azul; = 463 nm) por 30 min. A escolha do LED consistiu na proximidade entre o comprimento de onda do mesmo e do máximo de absorbância de algumas bandas dos complexos (Tabelas 8 e 9).
Figura 131 - Eletroforese em gel de agarose (1%) dos clorocomplexos FOR0212 e FOR0212A em diferentes concentrações, frente ao DNA plasmídico pBR322, na ausência de luz (faixas 3 a 8) e após irradiação por 30 min com LED azul (faixas 9 a 14). DNA controles positivo (com luz) e negativo (sem luz) nas faixas 1 e 2, respectivamente. Concentração em molL-1 (faixas): 5 (3 e 9), 10 (4 e 10), 20 (5
e 11), 40 (6 e 12), 60 (7 e 13) e 100 (8 e 14). 300 ng de DNA, 20molL-1 em pares de base.
Fonte: o autor.
Figura 132 - Eletroforese em gel de agarose (1%) dos nitrosilocomplexos FOR0912 e FOR0912A em diferentes concentrações, frente ao DNA plasmídico pBR322, na ausência de luz (faixas 3 a 8) e após irradiação por 30 min com LED azul (faixas 9 a 14). DNA controles positivo (com luz) e negativo (sem luz) nas faixas 1 e 2, respectivamente. Concentração em molL-1 (faixas): 5 (3 e 9), 10 (4 e 10), 20 (5
e 11), 40 (6 e 12), 60 (7 e 13) e 100 (8 e 14). 300 ng de DNA, 20molL-1 em pares de base.
Ao comparar o perfil eletroforético do DNA controle com o das amostras contendo o complexo FOR0212 (Figura 131), nota-se que, mesmo na ausência de luz, o complexo, acima de 10 mol L-1, promove alteração no DNA, de modo a surgir
a forma 2, porém ainda se verifica a existência da forma I. Semelhantemente, ocorre com o complexo FOR0212A a partir de 20 mol L-1. Antagonicamente, sob luz claro,
a clivagem ocorre a partir de 5 e 20 mol L-1 para FOR0212 e FOR0212A,
respectivamente, sem a existência da forma I. Isso significa que ambos compostos clivam DNA fotoinduzidamente. Tendo em vista que ambos complexos possuem bandas TCML do tipo *phen d(Ru) com valores de energia próximos da energia da fonte de irradiação (LED azul – 463 nm), essa transferência de elétrons pode induzir geração de radicais responsáveis pela clivagem do DNA.
Quanto à clivagem na ausência de luz, de acordo com NaiK e colaboradores, esta é propiciada na presença de ácidos de Lewis.55 Uma vez que
cloreto não forma ligação tão forte com Ru(II), há possibilidade de saída deste ligante e o metal, um centro ácido de Lewis, ser o promotor da clivagem.
No experimento com o composto FOR0912, foi observado também clivagem no escuro a partir de 5 mol L-1. Posto que o ligante nitrosilo é um ligante
forte frente a Ru(II), pode-se propor que, neste caso, o centro ácido de Lewis é o átomo de nitrogênio do grupo nitrosil. Assim, a princípio, esperar-se-ia um comportamento semelhante para o composto FOR0912A, o que não é observado. Essa distinção de resultados talvez se deva ao fato de que o pH em que há 50% de conversão nitrosilo-nitrocomposto para o complexo FOR0912 é maior (8,0) do que o pH das condições experimentais (pH = 7,4), ao passo que o do complexo FOR0912A é menor (6,5) - Figuras 99 e 100. Portanto, neste caso, em pH 7,4 a concentração de nitrosilocomplexo é bem menor que no experimento feito com FOR0912. Logo, a clivagem via ataque ao grupo nitrosilo não é tão expressiva no ensaio com FOR0912A.
Para as amostras submetidas à luz (faixas 9 a 14 – Figura 132), nota-se que, até 40 mol L-1, as manchas vão se tornando cumpridas à medida que se
aumenta a concentração. Isso indica que os complexos estão interagindo fortemente com o DNA e dificultando a migração do mesmo. Porém, a partir de 60 mol L-1, a
eficiente que os precursores, estes compostos também promovem clivagem fotoinduzidamente.
Como há um ombro em 450 nm nos espectros dos nitrosilocomplexos, que é atribuído à transferência de carga interligantes do tipo *(NO) (phen) e *(NO) (Tbz) para os complexos FOR0912 e FOR0912A, respectivamente, há possibilidade de se gerar NO e/ou HNO, sob luz. Nesse sentido, o ensaio de clivagem na presença de supressores de radicais como estes (NO e/ou HNO) é importante para desvendar o mecanismo de atuação dos compostos. Além disso, como os complexos precursores, que possuem carga +1, clivam DNA mais eficientemente que os respectivos nitrosilocomplexos, que possuem carga +3, avaliar a influência da força iônica é uma informação relevante. Sendo a glutationa um redutor, já conhecido, do grupo nitrosil,27, 32, 38 o comportamento eletroforético dos
compostos também foi avaliado na presença desta substância. Assim, para efetuar esses ensaios, selecionaram-se as concentrações de 20 (precursores) e 60 mol L-1
(nitrosilocomplexos).
Como já foi relatado, uma das formas de promover clivagem de DNA é via formação fotoinduzida de radicais – espécies reativas de oxigênio, de oxigênio e nitrogênio, de carbono, entre outros105-107. Assim, no intuito de compreender como os
complexos em estudo promovem a clivagem do DNA sob luz – já que os melhores resultados foram nessa condição –, avaliou-se o comportamento dos complexos (Figuras 133 e 134) frente a alguns supressores de radicais: Mannitol, L-histidina, TEMPO, SOD , cPTIO e DMSO, os quais são seletivos para os radicais descritos da Tabela 24.
Tabela 24 - Radicais e seus respectivos supressores.
Supressor Radical Supressor Radical
Mannitol Hidroxila SOD Superóxido
L-Histidina Oxigênio singlete cPTIO NO, HNO TEMPO Centrados no carbono DMSO Hidroxila
Figura 133 - Eletroforese em gel de agarose dos clorocomplexos FOR0212 e FOR0212A a 20 molL- 1, frente ao DNA plasmídico pBR322, na presença de supressores de radicais, sob luz. DNA controles
positivo nas faixas 1; DNA + complexo nas faixas 2; com supressor (faixas): Manittol (3), L-histidina (4), TEMPO (5), SOD (6), cPTIO (7) e DMSO (8). 300 ng de DNA, 20molL-1 em pares de base.
Fonte: o autor.
Figura 134 - Eletroforese em gel de agarose dos nitrosilocomplexos FOR0912 (faixas 2 a 8) e FOR0912A (faixas 9 a 15) a 60 molL-1, frente ao DNA plasmídico pBR322, na presença de
supressores de radicais sob luz. DNA controles positivo (com luz) nas faixa 1. DNA + complexo nas faixas 2 e 9. Supressor (faixas): Manittol (3 e 10), L-histidina (4 e 11), TEMPO (5 e 12), SOD (6 e 13), cPTIO (7 e 14) e DMSO (8 e 15). 300 ng de DNA, 20molL-1 em pares de base.
Fonte: o autor.
Ao comparar as Figuras 131 e 133, percebe-se que, sob estímulo fotoquímico e em presença de alguns supressores de radicais, não há inibição da clivagem quando os complexos FOR0212 e FOR0212A estão em presença dos supressores. Contudo, verificam-se manchas nas faixas 4 a 7 para o complexo com tioureia (gel superior da Figura 133) e na faixa 7 do gel inferior. Essas manchas indicam interação do composto com o DNA, de modo a dificultar a migração do mesmo. Adicionalmente, baseando-se na Tabela 24, os complexos FOR0212 e FOR0212A geram oxigênio singlete, radicais centrados no carbono e superóxido. Esse resultado era esperado para os complexos sem o grupo NO, em analogia com outros compostos semelhantes58. Entretando, posto que cPTIO é supressor seletivo
mais intensamente a mancha referente à forma II no gel contendo o complexo com tioureia (gel superior - Figura 133) e uma mancha com arraste entre as formas I e II no gel contendo o complexo com tiobenzamida (gel inferior - Figura 133). Tendo em vista que cPTIO contém centro básicos de Lewis (Figura 124) e que cloreto não é um ligante tão forte frente a Ru(II), pode-se propor que cPTIO se coordena a Ru(II), gerando um complexo que dificulta a migração do DNA.
Quanto aos nitrosilocomplexos, comparando-se as Figura 132 e Figura 134, verifica-se que há inibição no caso das faixas 2, 6 a 8, 10 e 13 a 15 da Figura 134. Isso indica os complexos, sob luz visível, geram superóxido, radical hidroxila e NO e/ou HNO. Contudo, não há relatos de que complexos desse tipo que gerem radical hidroxila.
Visto que os precursores e os nitrosilocomplexos são catiônicos e que o DNA possui carga negativa55, 108, a interação deste com os complexos pode ter uma
contribuição iônica significativa, o que pode interferir na habilidade de os complexos clivarem o DNA. No intuito de checar essa informação, utilizaram-se soluções de cloreto de sódio em uma concentração próxima daquela contida num meio externo a uma célula em repouso109– 150 mmolL-1– e em outra bem maior.
Com base no resultado obtido, para todos os compostos há mudança significativa do perfil eletroforético na presença de cloreto de sódio (Figura 135): os complexos deixam de clivar na presença dos íons cloreto e sódio. Isto significa que há comprometimento da interação do DNA, de natureza aniônica, com os complexos, que são catiônicos, por conta da presença dos supracitados íons em solução. Portanto, a contribuição iônica na clivagem do DNA é significativa, como era esperado. Contudo, sabendo-se que os nitrosilocomplexos clivam menos eficientemente o DNA pBR322 que os respectivos precursores, embora estes sejam menos carregados que aqueles, a interação iônica não é suficiente para explicar a diferença de habilidade das substâncias na clivagem de DNA. Provavelmente, a interação de bases nitrogenadas com o metal, no caso dos complexos FOR0212 e FOR0212A pode ser um mecanismo adicional para propiciar a estes compostos maior eficiência na clivagem.
Figura 135 - Eletroforese em gel de agarose dos complexos FOR0212 (faixas 2 a 4),FOR0212A (faixas 5 a 7) a 20 molL-1 e FOR0912 (faixas 8 a 10) e FOR0912A (faixas 11 a 13) a 60 molL-1,
frente ao DNA plasmídico pBR322, na presença de cloreto de sódio 150 (faixas 3, 6, 9 e 12) e 450 mmolL-1 (faixas 4, 7, 10 e 13). DNA controle negativo (sem luz) na faixa 1. DNA e complexo nas
faixas 2, 5, 8 e 11.
Fonte: o autor.
Tendo em vista que glutationa é um redutor biológico, avaliou-se o comportamento dos complexos frente à mesma, na ausência de luz (Figura 136). Para tanto, utilizou-se a concentração de 5 mmol L-1, que está na faixa de
concentração em que a mesma se encontra em meio biológico.
Figura 136 - Eletroforese em gel de agarose dos complexos FOR0212 (faixas 2 e 3), FOR0212A (faixas 4 e 5) a 20 molL-1 e FOR0912 (faixas 6 a 8) e FOR0912A (faixas 9 a 11) a 60 molL-1, frente
ao DNA plasmídico pBR322, na presença de GSH (faixas 3, 5, 7 e 9) e de GSH e cPTIO (faixas 8 e 11). DNA controle negativo (sem luz) na faixa 1. DNA e complexo nas faixas 2, 4, 6 e 9.
Fonte: o autor.
Com base na Figura 136, apenas o nitrosilocomplexo FOR0912 (faixa 6) cliva DNA, o que era esperado conforme discutido a partir dos dados de testes de concentração (Figuras 131 e 132). Na presença de glutationa e ausência de luz, não há evidência de promoção de clivagem na presença dos compostos precursores (faixas 3 e 5). Logo, embora já se esteja claro que esses compostos reagem com GSH, muito provavelmente o produto formado e/ou os intermediários, já que a reação como todo é lenta, não interagem com o DNA de modo a danificá-lo estruturalmente.
Quanto aos nitrosilocomplexos, nota-se que para o complexo com tioureia (faixa 7) não há alteração do perfil eletroforético, mas o complexo com tiobenzamida promove clivagem na presença de GSH e ausência de luz (faixa 10); resultado este esperado. Isso porque a literatura já reporta que essa classe de complexos é
reduzida pela glutationa, resultando na liberação de NO e/ou HNO11, 27, 38. Essa
informação, associada ao resultado obtido, sugere que NO e/ou HNO gerado promove a clivagem do DNA, na ausência de luz. Além do que, na presença de GSH e cPTIO, notou-se inibição da clivagem promovida pelo complexo FOR0912A. Isso indica que o radical gerado pela reação entre o complexo e GSH – NO e/ou HNO – reage com cPTIO, como já foi discutido, inibindo a clivagem. Isto evidencia que a clivagem promovida por este complexo depende de um dos (ou dos dois) radicais: NO e HNO.
No caso do complexo FOR0912, também não houve alteração no perfil eletroforético na presença de GSH e cPTIO. Como já foi evidenciado, este complexo não reage com cPTIO no escuro. Sendo assim, uma vez que não houve alteração na presença apenas de GSH, o óxido nítrico (e/ou HNO) não deve ter sido gerado e, portanto, não seria esperada alteração mediante cPTIO. Talvez, para este complexo seja necessário um tempo de incubação maior para que óxido nítrico seja gerado a partir de GSH e, por conseguinte, haver alteração na habilidade de clivar DNA.