Oligopol

As primeiras colheitas encerraram-se em 20 de junho de 2001. Neste momento, todas as serpentes do estudo já haviam sido introduzidas na quarentena, e duas tinham ido a óbito (Figura 15). As segundas colheitas e, portanto, as solturas das serpentes na baia externa, iniciaram em 11 de julho, concluindo-se em 21 de setembro de 2001. Neste período, mais sete serpentes tinham ido a óbito na quarentena e outras três, na baia. Em outubro, ocorreram três óbitos e, em novembro, outros 21 animais sucumbiram, 16 dos quais antes da terceira colheita. Em dezembro, mais nove serpentes foram a óbito, duas antes da terceira colheita. As terceiras colheitas iniciaram-se em 13 de novembro e encerraram em 11 de dezembro; destas, participaram 18 serpentes, das quais apenas seis estavam vivas em 20 de dezembro de 2001.

O período de permanência das 18 serpentes, oito fêmeas e 10 machos, participantes da terceira colheita, na baia externa, variou de 80 a 123 dias (Figura 12 e Anexo D). Com o manejo dos animais na baia, realizado como descrito no item 4.5.2, não era possível saber quais indivíduos haviam se alimentado ou regurgitado.

Durante as inspeções diárias, não havia como registrar as ecdises ou os sinais clínicos individualmente, a não ser que fosse feita a leitura do transponder. Como nesta tarefa a mão que segurava o leitor ficava muito próxima da serpente (Figura 3H), evitava-se realizá-la na baia. O grupo, como um todo, apresentava diminuição do reflexo e do

tônus muscular, quando manejado com o gancho e, também, sinais de dificuldade respiratória (Figura 14D, E e F).

Dentre os 24 animais, seis fêmeas e 18 machos, que vieram a óbito na baia externa (Figura 15), excetuando-se a serpente 44, que se apresentava em autólise avançada e, portanto, sem condições para colheita de amostras, apenas a número 28, primeira a sucumbir, foi negativa para o OPMV (Quadro 9). Daquelas 18 que sobreviveriam até a terceira colheita, três (nos 14, 30 e 33) também já haviam sido positivas para o vírus. Como já referido, este vírus, qualquer que tenha sido a fonte de infecção, provavelmente disseminou-se pelo plantel durante a permanência dos animais na quarentena e, aqueles animais não infectados neste período, o seriam, certamente, na baia. Daí, surgem as questões: quando cada serpente teria sido infectada? Quanto tempo teria decorrido desde o momento da infecção até o óbito? Por que uma grande porcentagem dos óbitos ocorreu no mês de novembro? O que levaria algumas serpentes a sobreviver por mais tempo que outras, mesmo estando infectadas?

O modo como este estudo pôde ser realizado, porém, torna estas perguntas difíceis de serem respondidas. Os animais não foram introduzidos todos ao mesmo tempo na quarentena, mas sim no decorrer de quase quatro meses (de 7 de março a 20 de junho). Além disso, os períodos de permanência neste local variaram, assim como as segundas colheitas e soltura na baia externa, que ocorreram num prazo de mais de dois meses. Estas condutas tornam quase impossível comparar o que ocorreu com este e aquele animal para distinguir os fatores que poderiam estar influenciando os acontecimentos e então, desta forma, tentar responder os questionamentos acima. Mesmo levando-se em conta estas limitações, entretanto, algumas análises dos dados relacionados podem ser efetuadas para a obtenção de informações importantes, ainda que não completamente elucidativas.

Comparando-se a mediana dos pesos, à segunda colheita, do grupo de 24 serpentes que vieram a óbito, com o grupo que sobreviveu, não foi observada diferença estatisticamente significativa (Tabela 3). Além dos sinais clínicos observados nos animais da baia como um todo, no grupo que foi a óbito antes da terceira colheita alterações haviam sido registradas na serpente 45 durante a primeira colheita, na serpente 50 durante a primeira colheita, quarentena e segunda colheita, e nas serpentes 53, 55 e 56 na segunda colheita (Quadro 3). Destes cinco animais, somente o no 56 havia sido positivo para o OPMV na segunda colheita. No restante do grupo, outros cinco também haviam sido positivos, os nos 34, 36, 42, 43 e 54 (Quadro 8). A respeito das pesquisas de bactérias e presença de nematóides pulmonares, estão no grupo que não sobreviveu dez das onze serpentes que apresentaram aumento do número de gêneros bacterianos isolados na segunda colheita (Quadro 12), quatro das sete nas quais bactérias foram visualizadas na citologia do lavado (Anexo F2) e as cinco que, antes negativas, foram positivas para a presença de vermes nas amostras da segunda colheita (Tabela 18). Comparando-se as medidas de tendência central das variáveis do hemograma, observou-se, no grupo de serpentes que foram a óbito, redução significativa do VG e dos valores da hemoglobina, e elevação dos valores de heterófilos e azurófilos (Tabela 13). Os valores do VG e hemoglobina estariam ainda dentro da normalidade, e de heterófilos e azurófilos também, ainda que no limite superior. Anemias hemolíticas podem resultar de septicemia, parasitemia ou toxemia, e aquelas por diminuição da produção de hemácias estão, usualmente, associadas com doenças inflamatórias crônicas, especialmente as causadas por agentes infecciosos (Thrall et al., 2004). Os heterófilos nos répteis são funcionalmente semelhantes ao neutrófilos nos mamíferos. Respondem à inflamação e infecção tecidual, sendo a fagocitose sua função primária. Uma elevação nos heterófilos circulantes indica resposta à doença inflamatória (infecção ou trauma), podendo

ainda ser causada por estresse e por influência sazonal, quando as concentrações destas células aumentariam no verão (Mader, 2000, Thrall et al., 2004). Em nosso caso, o aumento seria então ainda mais significativo, pois estaria ocorrendo no inverno. A contagem de azurófilos, que são monócitos com aparência azurofílica, elevar-se-ia por estímulo antigênico e doença infecciosa (Mader, 2000), porém variaria pouco com a estacionalidade (Thrall et al., 2004).

O período de tempo decorrido da entrada de 23 das 24 serpentes na baia externa, ao óbito, variou de um a 112 dias (Quadro 5). A serpente 46 veio a óbito algumas horas depois da segunda colheita, em decorrência de um acidente na passagem da sonda traqueopulmonar, provocando lesão pulmonar. O lavado obtido era praticamente composto de sangue, não possibilitando a realização da análise citológica da amostra. Na necropsia, foi confirmada a hemorragia pulmonar decorrente da lesão causada pela passagem da sonda. As culturas bacterianas, tanto de pulmão e traquéia, como do que foi obtido como lavado, foram negativas. Fato interessante, porém, foi o resultado positivo da segunda passagem da cultura celular da amostra de pulmão ao nested PCR para o OPMV, quando todos os testes com o “lavado”, obtido no mesmo dia, foram negativos (Quadro 9). O mesmo ocorreu com a serpente 50, a qual veio a óbito no dia seguinte ao da segunda colheita e entrada na baia: o resultado da segunda passagem da cultura celular da amostra de pulmão ao nested PCR para o OPMV foi positivo, quando todos os testes com o lavado, do dia anterior, haviam sido negativos. Para ambas as serpentes, como já acontecera com outras amostras, o nested PCR do macerado de pulmão foi negativo. Estes dois casos confirmam a hipótese de que, provavelmente, mais serpentes estariam infectadas pelo vírus, após a permanência na quarentena, do que o grupo de nove positivas nas amostras obtidas nas segundas colheitas (Quadro 8). Esta serpente 50, em especial, poderia já ter vindo portadora da natureza, considerando-se os sinais de dificuldade respiratória desde a primeira colheita (Quadro 3).

Teria sido este animal a fonte inicial da infecção? Todos os seus resultados anteriores haviam sido negativos para o OPMV, e os títulos à sorologia, inespecíficos. Elevou-se o número de gêneros bacterianos isolados no lavado da segunda colheita, devendo-se ressaltar o isolamento de Aeromonas hydrophila, que não havia sido recuperada antes, de amostras de pulmão, o que pode ter sido a causa imediata do óbito do animal. À necropsia, observou-se a caquexia, pois esta foi a serpente com a maior porcentagem total de perda de peso, 35,2%, após a ingestão de alimento uma única vez, em 111 dias de cativeiro; nos pulmões, nenhuma alteração significativa. Fato interessante é que as duas primeiras serpentes diagnosticadas positivas para o vírus após o óbito na quarentena, as nos 51 e 52, permaneciam em caixas contíguas a da serpente 50.

O peso das serpentes ao óbito (Quadro 5), a exceção de sete delas, reduziu-se, tendo sido encontrada diferença estatisticamente significativa entre as medianas do peso inicial do grupo, igual a 445 g, e do peso ao óbito, correspondente a 310 g. Apesar disso, à avaliação do estado geral, na necropsia, foi registrada a caquexia em apenas três serpentes, as nos 50, 57 e 45. A serpente 45 apresentou sinal de incoordenação, já na primeira colheita (Quadro 3), e nunca ingeriu alimento na quarentena (Anexo D). A 57, por sua vez, ingeriu o alimento duas vezes, uma das quais, regurgitou, e foi isolada Salmonella sp, tanto de suas amostras da segunda colheita, como da necropsia (Quadro 12).

Ainda com relação ao estado geral das serpentes à necropsia, apesar da redução do peso inicial e com exceção dos casos comentados nos parágrafos anteriores, verifica-se que, sobre a maioria delas nenhuma observação foi feita e, no caso de cinco, este foi considerado bom. Pode-se notar, também, pela forma como foi colocado o Quadro 5 que, com exceção das serpentes 28, 56, 55 e 54, com estado geral semelhante, todas as outras, a partir da número 53, foram a óbito a partir de 70 dias de permanência na baia externa e no período

compreendido entre 8 de novembro e 4 de dezembro. Outro fato que chama a atenção é que, salvo as serpentes 28, 42 e 45, as outras que foram a óbito após um menor período de tempo na quarentena, ordenadamente, as serpentes 50, 56, 55, 54, 53, 47 e 49, todas elas passaram pela segunda colheita de amostras na mesma data, em 20 de setembro. Nesta data, os lavados das serpentes 54 e 56 já eram positivos para o OPMV. Terá a contaminação das outras seis serpentes ocorrido durante esta segunda colheita? E a concentração dos óbitos no mês de novembro, terão estes ocorrido após um período médio de 60 dias a partir da soltura deste grupo de serpentes na baia, em setembro? A colheita de 20 de setembro foi a única, de todo o estudo, realizada com a utilização de um tubo de PVC, ao invés do laço de couro, para a contenção das serpentes, o que ocorreu pela ausência do técnico experiente no manuseio do laço. Cada serpente era conduzida para dentro do tubo até um ponto seguro, quando então se aplicava a injeção com o anestésico. Após a retirada de cada animal, o tubo era lavado com álcool 70% e aguardava-se que secasse, para reutilização. As colheitas nem sempre ocorriam por ordem numérica dos animais; supondo que a serpente 56 tenha sido a primeira a ser manipulada, se a desinfecção do tubo com o álcool não foi eficiente, este pode ter sido o momento do contágio de todo o resto do grupo. Esta seria uma hipótese plausível. Por outro lado, soube-se, após a necropsia, que, em 20 de setembro, as serpentes 46 e 50 já eram portadoras do OPMV, o que poderia também ser verdadeiro para as outras do grupo, ou seja, que o contágio tenha ocorrido durante a quarentena. Também se pode considerar que, antes de 20 de setembro, outras serpentes positivas para o vírus (Quadro 8) já haviam sido colocadas na baia externa, e poderiam ter sido as fontes de infecção. Quanto à concentração dos óbitos em novembro, poderia ter ocorrido por influência de condições climáticas, como, por exemplo, o início das chuvas do verão.

No exame macroscópico dos pulmões destas serpentes, submetidas à necropsia após o óbito na baia, verificou-se, ordinariamente, a presença de muco*, como exemplificado pelas fotografias da serpente 26 (Figura 16). Esta secreção seria a responsável pela dificuldade respiratória observada durante as inspeções diárias, como registrado na serpente 27 (Figura 14D, E e F), a qual apresentou secreção também na traquéia (Quadro 5). Como já descrito, as amostras de pulmão de todo o grupo, com exceção da serpente 28, foram positivas para o OPMV (Quadro 9). As serpentes 40 e 42, quando encontradas na baia, já não apresentavam condições para a observação macroscópica dos órgãos, por isso a necropsia não foi realizada, mas amostras de traquéia e pulmão foram submetidas às pesquisas de microrganismos. A presença de vermes foi constatada nas serpentes 36, 43, 49 e 50, as quais já haviam sido positivas anteriormente.

Com relação à pesquisa de bactérias nas amostras de pulmão e traquéia, verificou-se a presença de Salmonella nas serpentes 18, 26, 27, 28, 31, 34, 36, 49 e 57, das quais apenas a 49 e a 57 já haviam sido positivas nas amostras da segunda colheita (Quadros 12 e 13). Das 14 cepas de Salmonella identificadas, nove eram Salmonella

enterica subsp. diarizonae (O61:c). Pseudomonas aeruginosa foi isolada

em traquéia e pulmão das serpentes 31 e 36, e Pseudomonas putida, da serpente 26. Apenas no lavado da primeira colheita da serpente 31, após enriquecimento, havia sido isolada Pseudomonas fluorescens.

Aeromonas hydrophila foi isolada na traquéia da serpente 28 e pulmão da

serpente 50, não tendo sido isolada antes nestes animais.

As ocorrências analisadas nos parágrafos anteriores, em muitos aspectos, são coincidentes com as descritas nas publicações sobre paramixovirose dos ofídios. Cranfield & Graczyk (1996), como relatado no item 2.2.1.1, enfatizam que esta enfermidade não apresenta

* _{Resolvemos deixar o termo “muco” porque foi aquele utilizado desde o início, porém não está}

bem aplicado. Teria sido correto utilizar “exsudato” ou mesmo “secreção”, de aparência mucosa ou mucopurulenta.

sinais clínicos patognomônicos, podendo ocorrer a morte súbita, sem sinais clínicos premonitórios, ou o comprometimento respiratório e neurológico por seis a dez semanas, da exposição ao vírus até o óbito, que viria antes da resposta imune ser detectável. Outras possibilidades seriam a do doente crônico e do portador são, que atuariam como fontes de infecção e exibiriam altos títulos de anticorpos. Em nosso estudo, os ocorridos com as serpentes que foram a óbito na quarentena e na baia antes da terceira colheita poderiam encaixar-se no primeiro e segundo casos. As serpentes 45 e 50, nas quais foram observados sinais clínicos desde a primeira colheita, talvez pudessem ter sido casos crônicos e fontes de infecção para o resto do plantel. Apesar de terem apresentado títulos de anticorpos considerados inespecíficos e lavados negativos, na data da segunda colheita, verificou-se que ainda assim o vírus poderia já estar no pulmão, como diagnosticado na serpente 50. A presença de “muco” nos pulmões, achado relatado na maior parte das necropsias das serpentes que foram a óbito na baia, também é relatada por Jacobson et al. (1981), que se referem a um “exsudato mucóide e algumas vezes caseoso” no pulmão como o principal achado de necropsia, e por Jacobson et al. (1992), da mesma forma a um “exsudato branco e mucóide”, em duas epizootias causadas pelo OPMV em serpentários de zoológicos. Com relação à presença de bactérias em amostras de pulmão, nestes mesmos trabalhos os autores relatam o isolamento, na maior parte, de Gram-negativas, como P. aeruginosa, P. maltophilia,

Pseudomonas spp, M. morganii, P. mirabilis, E. coli, Arizona sp, Salmonella arizonae, S. marcescens e A. hydrophila, gêneros também

encontrados em nosso estudo.

6.5 Informações da terceira colheita de amostras das serpentes