A formação de um biofilme apresenta três etapas principais (figura 8). Inicia-se pela aproximação dos microrganismos a uma superfície (biótica ou abiótica) e adesão primária, seguida de adesão secundária e finalmente a maturação do biofilme com
produção da matriz extracelular [15,158].
Figura 8 – Etapas de formação de um biofilme numa superfície abiótica. (A) Adesão inicial à superfície;
(B) Formação de camadas basais de microcolónias; (C) Biofilme maduro com matriz extracelular [159]
O processo inicia-se então pela adesão primária, que após aproximação dos microrganismo até à distância crítica (<1nm) vai depender do somatório das forças repulsivas e atrativas entre microrganismo e superfície de adesão. Forças como as de
Van der Waals têm uma influência positiva para esta adesão inicial, contrariamente às forças eletrostáticas que tendem a repelir microrganismos e superfícies de adesão, já que a maioria das superfícies, bióticas e abióticas, estão carregadas negativamente [160]. Esta adesão inicial é também mediada por outras características da parede celular dos microrganismos como a hidrofobicidade e promovida por adesinas presentes na mesma [138], tal como já referido na secção 3.4. Além disto, diversos fatores ambientais influenciam a adesão inicial, como o fluxo do meio circundante (urina, sangue, saliva ou muco), pH, temperatura, osmolaridade, bactérias, presença de agentes antimicrobianos e fatores de imunidade do hospedeiro [161,162].
Na fase seguinte de formação de um biofilme, designada de adesão secundária, há consolidação da adesão dos microrganismos fracamente aderidos e formação de camadas basais de microcolónias. Esta fase é caracterizada por diversos fenómenos como a produção de exopolissacáridos que formam complexos com a superfície de adesão, assim como a presença de recetores específicos na superfície da parede celular que auxiliam a adesão entre os microrganismos e a superfície [163].
Após a adesão dos microrganismos às superfícies bióticas ou abióticas processa- -se a maturação do biofilme, que é acompanhada pela produção da matriz extracelular. Um biofilme maduro com aproximadamente 48 horas de crescimento, consiste numa densa rede de células constituída por microcolónias de microrganismos embebidas na matriz, sendo esta uma das características mais distintivas de um biofilme microbiano [164]. A matriz extracelular é uma estrutura tridimensional tipo gel, altamente hidratada e localmente carregada, na qual as microcolónias estão largamente imobilizadas e separadas por canais de água que fornecem um mecanismo para a circulação de
nutrientes no biofilme [165,166].A difusão de nutrientes e oxigénio do meio através da
matriz e libertação de resíduos pela mesma, são então fatores determinantes para a maturação do biofilme, controlada por diversos fatores ambientais como a composição do meio, oxigénio e pH [138,167]. Num biofilme maduro há normalmente inativação das células mais próximas da superfície que poderão posteriormente morrer por falta de acesso a nutrientes e oxigénio ou acumulação de metabolitos tóxicos. No final do processo de maturação, é atingido um equilíbrio dinâmico em que a libertação de células plantónicas que colonizarão outras superfícies compensa o crescimento celular dentro do biofilme [160]. Não só a maturação, mas todas as etapas de desenvolvimento do biofilme, são reguladas pela expressão de genes que é controlada pela transmissão de sinais entre as células e dependente da densidade populacional [160,168].
Tal como já referido, microrganismos como fungos pertencentes ao género
Candida, incluindo as espécies de CNA
têm a capacidade de produzir biofilmes
glabrata estirpe BG2, formado em superfície de plástico e meio YPD
Dextrose”). Embora a técnic
normalmente não permita a visualização d
mesma são percetíveis com a maior amplificação (imagem mais à direita da figura 9)
Figura 9 – Biofilme de C. glabrata
37ºC (da esquerda para a direita aumento da amplificação da imagem
A estrutura e a composição da matriz dos biofilmes dependem da espéci
da estirpe envolvida no mesmo, assim como de fatores ambientais como a composição
do meio [150]. Assim, por exemplo
outras espécies de CNA como meios de cultura ricos como o
oposto em superfícies de silicone na presença de urina onde quantidade de biomassa de biofilme
mais compactos que outras espécies de
pseudo-hifas, como se pode verificar na figura 9. O estudo com correspondente a esta figura permitiu também demonstrar
apresentam maior adesão e formação de biofilme na fase estacionária do que na fase logarítmica de crescimento
Em comparação com formação de biofilmes de espécies
biofilme envolve adesão entre as células e a superfície assim como
Tal como já referido, microrganismos como fungos pertencentes ao género espécies de CNA de elevado impacto médico como
têm a capacidade de produzir biofilmes [150].A figura 9 apresenta um biofilme de
formado em superfície de plástico e meio YPD
. Embora a técnica usada para preparar as células nesse estudo nte não permita a visualização da matriz extracelular, estruturas residuais
com a maior amplificação (imagem mais à direita da figura 9)
C. glabrata, estirpe BG2, formado em superfície de plástico com meio YPD a a esquerda para a direita aumento da amplificação da imagem) [
estrutura e a composição da matriz dos biofilmes dependem da espéci
da estirpe envolvida no mesmo, assim como de fatores ambientais como a composição por exemplo, C. glabrata forma biofilmes mais finos que as como C. parapsilosis e C. tropicalis quando em presença de de cultura ricos como o SDB (“Sabouraud Dextrose Broth”),
oposto em superfícies de silicone na presença de urina onde C. glabrata
biomassa de biofilme [150]. Além disso, esta espécie apresenta biofilmes outras espécies de Candida sem qualquer evidência de hifas ou como se pode verificar na figura 9. O estudo com
correspondente a esta figura permitiu também demonstrar que as células desta espécie
o e formação de biofilme na fase estacionária do que na fase [169].
Em comparação com C. albicans, pouco se sabe sobre os genes
formação de biofilmes de espécies de CNA como C. glabrata [35]. A formação de um
e adesão entre as células e a superfície assim como
Tal como já referido, microrganismos como fungos pertencentes ao género impacto médico como C. glabrata, A figura 9 apresenta um biofilme de C. (“Yeast Peptone nesse estudo [169] a matriz extracelular, estruturas residuais da com a maior amplificação (imagem mais à direita da figura 9).
e plástico com meio YPD a [169]
estrutura e a composição da matriz dos biofilmes dependem da espécie e até da estirpe envolvida no mesmo, assim como de fatores ambientais como a composição biofilmes mais finos que as quando em presença de , acontecendo o
C. glabrata produz a maior
esta espécie apresenta biofilmes sem qualquer evidência de hifas ou como se pode verificar na figura 9. O estudo com C. glabrata que as células desta espécie o e formação de biofilme na fase estacionária do que na fase pouco se sabe sobre os genes envolvidos na A formação de um e adesão entre as células e a superfície assim como adesão entre as
próprias células que o constituem, e por isso genes responsáveis pela expressão de
adesinas são essenciais para o seu desenvolvimento [170]. Tal como já referido na
secção 3.4, as adesinas são proteínas da parede celular que promovem a adesão e em C.
glabrata as da família Epa são consideradas importantes [132]. Nesta espécie, as
adesinas codificadas pelos genes EPA6 e EPA7 têm sido implicadas na formação de biofilmes [169]. Um estudo de 2005 com mutantes de C. glabrata [169], obteve resultados que permitiram sugerir que a Epa6 não está envolvida na adesão a superfícies
de plástico mas sim na adesão entre as células do biofilme. De facto, a Epa6 é
considerada uma das adesinas mais importantes na formação de biofilmes de C.
glabrata, sendo altamente induzida durante este fenómeno e a sua ausência reduz a
produção de biofilmes in vitro. A expressão desta adesina é também induzida na presença de ácido sórbico e parabenos, que são usados como conservantes em alimentos e produtos de saúde (por exemplo em agentes de limpeza da pele) [171]. Além dos genes EPA6 e EPA7, outros genes têm sido identificados no processo de formação de biofilme de C. glabrata, como o RIF1, SIR4 e YAK1. Os dois primeiros codificam a Sir4 e a Rif1, duas proteínas envolvidas no silenciamento subtelomérico e que regulam a transcrição das proteínas codificadas pelos genes EPA6 e EPA7, localizados nas regiões
subteloméricas. A Yak1 é uma cinase que controla o silenciamento subtelomérico das
duas proteínas atrás referidas (Sir4 e Rif1), regulando a expressão da Epa6 [169]. Assim, a manutenção da estrutura telomérica onde se encontram os genes EPA e a regulação do mecanismo de silenciamento têm papéis importantes na formação de
biofilmes de C. glabrata [172]. Um estudo recente [172] identificou novos genes
envolvidos na formação destes biofilmes, demonstrando que a expressão da Epa6 é regulada positivamente pelo complexo de cromatina Swi/Snf e que a transcrição do fator Cst6 regula negativamente a trancrição dessa adesina.