município de Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil
3.1.1. Localização geográfica e condições climáticas
O município de Belo Horizonte se encontra no estado de Minas Gerais, latitude - 19.8157, longitude -43.9542, a 19º 48’ 57” Sul e 43º 57’ 15”. Possui altitude de 858 metros a cima do nível do mar. Seu clima é considerado subtropical úmido.
3.1.2. Delineamento e seleção dos animais Foi realizado um estudo descritivo e transversal, utilizando 224 animais de tração oriundos de Belo Horizonte, Minas Gerais. Tais animais são pertencentes aos carroceiros do município, devidamente inscritos no projeto de extensão “Correção Ambiental e Reciclagem com Carroceiros de Belo Horizonte” (Projeto Carroceiros). Este é um projeto de extensão da Escola de Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais em parceira com a Prefeitura Municipal de Belo Horizonte. Semanalmente são realizadas visitas às Unidades de Recolhimento de Pequenos Volumes (URPVs), nas quais os carroceiros depositam entulhos da construção civil, madeira, podas de árvores e jardins, pneus e móveis descartados.
Durante as visitas os estudantes de graduação do curso de Medicina Veterinária realizam o cadastramento e marcação, após a realização de um questionário socioeconômico com o proprietário. Os animais recém-cadastrados e os previamente cadastrados recebem vacinação antirrábica e são feitas as coletas de sangue para realização de exames sorológicos e hematológicos. Além da vacinação dos animais, os carroceiros têm direito a assistência médico veterinária por menores custos no Hospital Veterinário da Escola de
Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais (HV-EV/UFMG).
O município de Belo Horizonte é dividido, desde 1983, em nove unidades administrativas, denominadas Regionais. As amostras utilizadas no estudo são provenientes de oito Regionais Administrativas, com exceção da Regional Centro-Sul, devido ao fato de os carroceiros serem proibidos de circularem dentro do perímetro urbano delimitado pela Avenida do Contorno.
3.1.3. Coleta e processamento do material A coleta e o processamento do material foram semelhantes nos experimentos, exceto a coleta dos carrapatos, realizada apenas nas propriedades estudadas.
Dos animais que apresentavam infestação por carrapatos foram coletados por amostragem aleatória e conservados em álcool 70%, para posterior identificação. No laboratório de Protozoologia do Instituto de Ciências Biológicas da UFMG os carrapatos coletados foram identificados (Aragão e Fonseca, 1961).
A coleta do sangue foi realizada através de venulopunção da jugular externa, após contenção dos animais em tronco e antissepsia do local, utilizando algodão embebido em álcool 70%. Foram coletados dois tubos a vácuo, sendo um deles sem anticoagulante e outro contendo ácido etilenodiamonio tetra-acético (EDTA). 3.1.3.1. Hemograma e bioquímica sérica No mesmo dia da coleta de sangue, a partir do tubo com EDTA, foram confeccionados, em duplicata, esfregaços sanguíneos, corados pelo método de Romanowsky1, para exame celular diferencial. Com o auxílio de
1 Panótico para colorações de esfregaço – Laborclin –
Pinhais, Brasil
uma centrífuga de microhematócrito2 foram preparados microtubos utilizados para a determinação do hematócrito, das proteínas plasmáticas totais, do fibrinogênio e para a confecção de esfregaços com a capa de leucócitos, também em duplicata. A hematimetria foi determinada em contador automático de células3, através do método de impedância. Os esfregaços sanguíneos e de capa leucocitária foram confeccionados de acordo com a técnica descrita por Cowell e Tyler (2002) e secos à temperatura ambiente.
A contagem diferencial de leucócitos foi realizada em microscópio óptico e sob imersão. Foram contados 100 leucócitos ao longo do corpo do esfregaço sanguíneo. Após a obtenção dos valores relativos, foram calculados os valores absolutos.
Para determinação do fibrinogênio utilizou- se a técnica descrita por Kaneko et al. (2008) e realizadas duas leituras, através de refratometria, do plasma. A primeira, logo após centrifugação do tubo capilar e a segunda após aquecimento do tubo capilar a 56º C por três minutos e nova centrifugação. O valor do fibrinogênio foi obtido pela diferença entre as duas leituras.
O restante do sangue total foi aliquotado em tubos plásticos cônicos de 0,5 ml e armazenados em freezer a temperatura de - 20°C para posterior análise da presença do A. phagocytophilum, por meio da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).
Após a retração do coágulo, o tubo sem anticoagulante foi centrifugado4 a 3000 rotações por minuto (rpm) (1106,82 x g), durante cinco minutos, e o soro obtido foi congelado a -20ºC, em pelo menos seis alíquotas de 0,5 ml.
2 H-240 - Centribio
3 Abacus Júnior Vet – Hematology Analyser, Diatron – São
Paulo, Brasil
O soro foi analisado em aparelho semiautomático de bioquímica sanguínea5, com kits específicos6. As análises realizadas constaram do perfil renal (uréia e creatinina) e hepático (Gama glutamiltransferase [GGT], Aspartato aminotransferase [AST], Alanina aminotransferase [ALT], Fosfatase alcalina [FA], albumina e proteínas totais).
3.1.4. Métodos diagnósticos 3.1.4.1. Exame direto
As lâminas de esfregaço de capa leucocitária foram analisadas em microscopia óptica, em aumento de 1000 vezes e em objetiva de imersão para procura de inclusões intracitoplasmáticas de A. phagocytophilum em neutrófilos. A leitura foi feita em toda a extensão do esfregaço, totalizando a contagem de 100 neutrófilos. Foi considerado positivo o animal que apresentasse inclusões intracitoplasmáticas, independentemente do percentual de células infectadas.
3.1.4.2. Reação de imunofluorescência indireta (RIFI)
Foram utilizadas as amostras de soro congeladas a -20ºC pertencentes à soroteca do Projeto Carroceiros. Lâminas de vidro próprias para RIFI7, contendo 12 poços que foram previamente fixados com o antígeno proveniente do cultivo de Anaplasma phagocytophilum mantido em IDE8 no
789.
Laboratório de Protozoologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais. A técnica utilizada para
5 Analisador Semi automático
6 Bioclin – Quibisa Química Básica – Belo Horizonte, Brasil 7 Perfecta – São Paulo - Brasil
8 Anti-Horse IgG (whole molecule) – FITC antibody
produced in rabbit – Sigma-Aldrich- St. Louis, USA
9 Microscópio
fabricação e fixação do antígeno foi adaptada da descrita por Aguiar et al. (2007).
Após padronização prévia da técnica, as amostras foram diluídas na proporção de 1:160, em salina fosfatada tamponada 1x (PBS 1x), que foi considerado o ponto de corte para a análise, e então pipetadas nos poços. Permitiu-se que o soro diluído reagisse com o antígeno da lâmina por 30 minutos, em câmara úmida a 37ºC. Após esse tempo as lâminas passaram por três lavagens, a primeira e a segunda com PBS 1x e a última com água destilada, sendo que, depois de cada lavagem as lâminas foram submergidas em PBS 1x e água destilada, respectivamente, durante três minutos. As lâminas foram secas a temperatura ambiente. Após secagem, foi pipetado em cada poço, o conjugado anti IgG equina8, previamente diluído em Azul de Evans na proporção de 1:160, e repetiu-se a primeira reação exatamente como descrita acima. Ao final, as lâminas foram cobertas com glicerina alcalina e lamínula e lidas em microscópio de epifluorescência9 As amostras foram consideradas positivas, quando, à microscopia de fluorescências o antígeno apresentou fluorescência, na diluição de 1:160, que foi utilizada como ponto de corte neste experimento (Fig. 1 e 2). Utilizou-se PBS 1x como o branco e o soro de um animal sabidamente positivo para o agente foi utilizado como controle positivo para todas as reações.
Após a triagem, as amostras consideradas positivas, foram novamente diluídas para se avaliar a titulação do IgG desses animais. As diluições utilizadas foram 1:320, 1:640 e 1:1280.
Figura 1: A: Reação de Imunofluorescência Indireta negativa. Observar as células IDE8 contendo inclusões de A. phagocytophilum sem ligação do conjugado. B: Reação de Imunofluorescência Indireta positiva. Observar fluorescência do conjugado ligado à membrana citoplasmática do A. phagocytophilum. Aumento: 400x
3.1.4.3. Avaliação molecular 3.1.4.3.1. Extração do DNA
Para realização da PCR foram utilizadas as amostras de sangue total, aliquotadas e congeladas em freezer a -20º. A extração de DNA das amostras foi realizada com o kit Wizard® Genomic DNA Purification10, de acordo com o recomendado pelo fabricante para extração de amostras de 300 µL. 3.1.4.3.2. Amplificação do DNA
11
Para amplificação do DNA extraído das amostras foi utilizado a técnica de nested PCR, com o objetivo de aumentar a sensibilidade do teste. Esta técnica se baseia em submeter as amostras a duas reações de amplificação do alvo desejado. Durante a primeira reação há amplificação do alvo contendo maior número de pares de base e na segunda há amplificação de uma parte específica de pares de base contidos dentro do que foi amplificado na primeira reação.
10
Promega Corporation - USA
11 Eppendorf Mastercycler Personal®, Eppendorf, Hamburgo,
Alemanha.
Os iniciadores utilizados, tanto para a primeira quanto para a segunda reação, foram aqueles utilizados por Silaghi et al. (2012) e estão descritos na Tab. 1. Os iniciadores utilizados possuíam como alvo o gene msp4, responsável pela expressão de uma proteína de membrana do agente de mesmo nome.
A amplificação foi feita utilizando-se termociclador automático11 e o programa utilizado encontra-se descrito na Tab. 2. Como controle positivo utilizou-se DNA extraído a partir de cultura celular contendo o agente e como brancos da primeira e da segunda reação utilizou-se aqui miliequivalente. Para as reações, utilizou-se 13,5 µl de mix para PCR adicionado de 1,5 µl de DNA (1ª reação) ou produto de PCR (2ª reação). Os componentes da mix para PCR estão sumarizados na tab 3.
Tabela 1: Sequência dos iniciadores utilizados na primeira e na segunda reação de nested PCR, para identificação do agente
E spec if ici dad e A . phagocy toph il u m
Sequência do primer (5’- 3’) Alvo Nome
T am anh o do produ to (pb ) R ef er ênci a 1ª reação ATGAATTACAGAGAATTGCTTGTAGG TTAATTGAAAGCAAATCTTGCTCCTATG msp4 MSP4AP5 MSP4AP3 849 de la Fuente et al. 2005 2ª reação CTATTGGYGGNGCYAGAGT GTTCATCGAAAATTCCGTGGTA msp4 msp4f msp4r 381 Bown et al. 2007
Tabela 2: Programa submetido ao termociclador automático para realização do nested PCR para amplificação para A. phaocytophilum, utilizando os iniciadores MSP4AP5 e MSP4AP3, para a primeira reação e os iniciadores msp4f e msp4r, para a segunda reação
Ciclo Passo Temperatura (ºC) Duração
1 (1x) Desnaturação inicial 94 5 min
2 (29x) Desnaturação Anelamento Extensão 92 54 72 1 min 1 min 2 min
3 (1x) Extensão final 72 8 min
4 “Hold” 12 -
Tabela 3: Condição para reação de nested PCR para Anaplasma phagocytophilum utilizando os iniciadores MSP4AP5 e MSP4AP3, para primeira reação e os iniciadores msp4f e msp4r, para a segunda reação.
Reagente Volume (µl)
GoTaq® Green Master Mix12 7,5
H2O MiliQ 5,4
Mix primer (f+r) (10mM) 0,6
DNA/Produto 1ª reação 1,5
1213
14Os produtos obtidos após a segunda reação
foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1% em tampão TAE (0,5 X). Foram aplicados 5µL dos produtos, juntamente com 1µL do corante gel red13 (1µl/10µl de TAE 0,5X) em cada canaleta do gel. Como padrão foi utilizado 1Kb Ladder Plus14. Após aplicação dos produtos e padrão, o gel foi submetido a um campo elétrico de 100V, por aproximadamente 25 minutos e, então,
12 Biotium - USA
13 Fermentas – Thermo Fisher Scientific Inc. - USA 14 PROMEGA – USA
observado em lâmpada de UV. Observou-se a formação de banda nas canaletas das amostras e comparou-se com as bandas formadas pelo padrão e pela amostra positiva. Além disso, observou-se se houve formação de bandas nos brancos, tanto da primeira quanto da segunda reação a fim de se descartar possíveis contaminações durante o processo.
3.1.4.3.3. Sequenciamento nucleotídico As amostras que apresentaram banda após eletroforese em gel de agarose 1% foram submetidas a purificação pelo polietilenoglicol 20% (PEG 20%) para posterior sequenciamento nucleotídico. A purificação teve como objetivo eliminar bandas com peso molecular abaixo de 300- 400 pb.
Primeiramente, todo o produto de PCR foi transferido para um tudo de plástico de 1,5ml e, então, foi adicionado o mesmo volume de PEG 20%. A mistura foi homogeneizada em “vortex” e os tubos foram colocados em banho-maria a 37ºC por 15 minutos. Depois de decorrido o tempo, os tubos foram centrifugados a 13000 rpm por 15 minutos. O sobrenadante foi retirado, cuidadosamente, com auxílio de uma pipeta. Adicionou-se 125µl de etanol 80% gelado e centrifugou-se a 13000 rpm por 5 minutos. Novamente o sobrenadante foi descartado. Repetiu-se os três últimos passos. Permitiu- se que as amostras secassem a temperatura ambiente overnight. No dia seguinte as amostras foram ressuspendidas com tampão EB num volume de ~20µl.
Após purificação, as amostras foram submetidas à avaliação da quantidade de produto de PCR presente através de espectrofotometria15. As amostras foram então preparadas para o sequenciamento conforme exigido pelo laboratório (Myleus Biotechnology) e então analisadas por eletroforese capilar em aparelho ABI3130, utilizando-se o polímero POP7 e BigDyev3.1.
15 Nanodrop – Thermo Scientific Fisher Inc. – USA.
3.2. Avaliação clínica e laboratorial da