8.5 Noisy Observation
9.1.1 Observation from AI State
CAPÍTULO II
BIOMARCADORES PARA O DIAGNÓSTICO DE
TUBERCULOSE PELA SALIVA
BIOMARCADORES PARA O DIAGNÓSTICO DE TUBERCULOSE
PELA SALIVA
Léa D. S. Morais, Fabiana A. A. Santos, Ana Paula Carneiro, Luiz Ricardo Goulart Filho
Laboratório de Nanobiotecnologia, Instituto de Genética e Bioquímica, Universidade Federal de Uberlândia
A detecção de IgA positiva para tuberculose (TB) na saliva, com o uso das sondas TBC10 e/ou TB2C10, oferece perspectivas para diagnóstico sensível e point-of-care
A TB é um grave problema de saúde pública, responsável pela morte de mais de um milhão de pessoas por ano. A contenção da disseminação da doença depende da descoberta de casos novos. Um diagnóstico acurado, rápido e acessível é crucial para a contenção do fluxo infeccioso. A partir de motivos proteicos de um fago (C10) fusionado com peptídeo mimético a proteínas de Mycobacterium tuberculosis, sintetizamos os peptídeos TBC10 e TB2C10, e avaliamos suas aplicações em ensaios imunoenzimáticos e biossensores para o diagnóstico da TB através da saliva. As sondas foram caracterizadas através de ferramentas de bioinformática e do uso de fragmentos de anticorpos do tipo scFv selecionados por Phage Display. Testadas por ELISA contra 59 amostras salivares pra detecção de IgA, apresentaram sensibilidade maior que 94% e especificidade superior a 76,9%, com valor de p <0,0001. Os testes dos peptídeos em sensor eletroquímico apresentou capacidade de discriminar positivos de negativos. Fragmentos de anticorpos scFv selecionados contra fago C10, apresentou reatividade a proteínas de M.
tuberculosis, em ensaios ELISA e permitiu a imunocaptura da proteína alvo para
caracterização. A detecção de IgA específica para TB na saliva é uma alternativa promissora, pois mostrou eficácia para discriminar doentes de saudáveis, além de ser uma amostra com riscos mínimos, de coleta fácil e não invasiva. Os biomarcadores TBC10 e TB2C10 apresentaram alto potencial de aplicação para diagnóstico de TB através da saliva.
Introdução
A tuberculose (Tb) é uma doença antiga e está entre as 10 que mais assolam a humanidade. Diretamente associada à pobreza, condições sanitárias precárias, nutrição e imunidade comprometida, a Tb foi responsável pela morte de 1.4 milhões em 2015 (WHO, 2016). É causada pelo Mycobacterium tuberculosis, um bacilo intracelular que tem capacidade de escapar da resposta imunológica de seu hospedeiro, e permanecer em latência no interior de macrófagos por períodos prolongados, caracterizando assim a infecção latente (LTBI). Esta condição pode ser alterada por um estresse imunológico, capaz de reativar a infecção originando a doença ativa, fase em que o doente libera o bacilo através de perdigotos quando espirra ou tosse transmitindo a outros indivíduos (FLYNN, JOANNE L; CHAN, 2001). É importante destacar que indivíduos com LTBI não transmitem a doença, contudo controlar esta infecção e impedir o desenvolvimento da doença ativa são medidas válidas e promissoras na redução da incidência.
A capacidade do bacilo de sobreviver no interior de macrófagos do hospedeiro se dá pela interação de proteínas secretadas ou presentes na parede celular da micobactéria com a célula fagocítica. As hsp (Heat Shock Proteins) são uma classe de proteínas com expressão aumentada em decorrência de estresse térmico ou químico, e são agrupadas em famílias de acordo com suas sequências de aminoácidos e pesos moleculares (CASTRO et al., 2013). Hickey e colaboradores (2009) observaram que uma recombinante de hsp65, tinha habilidade para inibir a associação do bacilo com macrófago, demonstrando a funcionalidade de adesina da chaperonin60.2 em relação à interação com macrófagos. Essas e outras proteínas, como ESAT-6, CFP-10, MPT64, Ag85, com papel importante na virulência bacteriana, são potenciais biomarcadores para o diagnóstico de Tb (GAO
et al., 2004; GOLDBERG; SAINI; PORCELLI, 2014; RENSHAW et al., 2005; XU et al., 2007)
A busca eficiente de novos casos, aliada ao tratamento monitorado, é a melhor alternativa para contenção da disseminação da Tb. Os achados bacteriológicos e radiológicos são os principais métodos de diagnósticos, e em algumas regiões também são usados testes imunoenzimáticos. Contudo, os métodos diagnósticos utilizados são limitados, por não agregarem, em um único
teste, a sensibilidade e agilidade essenciais para o início efetivo do tratamento e contenção da propagação do bacilo (BENTO et al., 2011).
A saliva possui características físico-químicas favoráveis, das quais podemos enumerar a peculiar representatividade do real estado do organismo, conferido pela atividade constante das glândulas salivares; a disponibilidade de Imunoglobulinas A em níveis satisfatórios para a realização de ensaios imunológicos; a viabilidade de coleta não especializada, não invasiva e indolor; o risco biológico menor quando comparado a outros espécimes clínicos e pode ser considerada uma boa escolha como amostra para diagnóstico de várias doenças (GRIFFIN et al., 2015; LAWRENCE, 2002; SHIN et al., 2013; TABAK; PH, 2001; ZHANG, JIENI et al., 2012).
A tecnologia de phage display é uma importante ferramenta, que tem sido amplamente usada para seleção de diversificados ligantes para diferentes finalidades (BRATKOVIČ, 2009; KALANTRI, 2005). Peptídeos e fragmentos de anticorpos são expressos em bacteriófagos, por métodos padronizados com menor tempo de produção e importante aplicabilidade no diagnóstico devido alta especificidade da molécula selecionada para o alvo (ARAÚJO et al., 2014; HOOGENBOOM, 2005; LEVENHAGEN et al., 2015). Neste estudo, utilizamos a tecnologia de phage display para caracterização de biomarcadores e ensaios imunologicos para avaliar a utilização destes em plataformas para o diagnóstico de TB pela detecção de IgA na saliva. Para a caracterização utilizamos um peptídeo de 12 aminoácidos fusionado a um fago, C10, previamente selecionado por phage display contra IgA de saliva de indivíduos com tuberculose. Em análises anteriores, o fago C10 foi capaz de discriminar em imunoensaios indivíduos com TB ativa e indivíduos com TB após tratamento e indivíduos controles (Figura S01). As sequências obtidas dos peptídeos estão protegidas por patente (BR 10 2017 015071 2) ANEXO A.
Resultados
Síntese de Peptídeos
Com base no motivo proteico de 12 aminoácidos do peptídeo fusionado ao fago C10, dois peptídeos foram sintetizados, TBC10 com 24 aminoácidos (motivo proteico, espaçador e parte da PII), e TB2C10 com 32 aminoácidos (motivo proteico,
espaçador, motivo proteico e BSA), (GeneScript /Piscataway, NJ, USA). Os motivos proteicos e a estrutura 3D dos peptídeos estão representados na Figura 01.
Figura 01: Representação sequencial e estrutura molecular dos peptídeos TBC10 e TB2C10. TBC10 - Motivo proteico de 12 aminoácidos em verde, espaçador e parte da PIII do fago em amarelo, TB2C10 – Motivo proteico se 12 aminoácidos em verde, motivo proteico duplicado em verde limão e espaçador em amarelo. *As sequências estão protegidas.
Imunorreatividade e Biossensor
O fago C10 e os peptídeos TBC10 e TB2C10 apresentaram sensibilidade de 94,12% para discriminar positivos de negativos, e especifidade maior que 76,9%. As curvas ROC apresentaram área maior que 0,9367, com valores de p< 0,001. A análise de correlação entre os alvos apresentou valor igual a 0,94, indicando que a resposta dos peptídeos sintéticos foi similar à do peptídeo de origem C10 (Figura S02). O percentual de IgA alvo-específica em relação à IgA total foi maior para o grupo positivo no início do tratamento (PNT) em relação aos demais, com discreto aumento pra os indivíduos controles positivos para o teste tuberculínico (NP+) (Figura S03). Os indicativos diagnósticos estão apresentados na Figura 02.
Figura 02: ELISA Avaliação em ELISA da reatividade de C10, TBC10 e TB2C10 frente a IgA de saliva de indivíduos positivos para Tb no início do tratamento (PNT), de indivíduos
positivos para Tb com tratamento em curso (PT), indivíduos sadios PPD+ (NP+) e indivíduos sadios PPD- (NP-). Representação das curvas ROC geradas a partir do ELISA, com seus respectivos valores de sensibilidade (Se), especificidade (Sp), Odds Ratio (OR), Intervalo de confiança (IC), área da curva ROC (AUC) e valor de p.
Os peptídeos TBC10 e TB2C10, imobilizados em eletrodos de grafite (Ds dropsens Drp-110), permitiram discriminar positivos (PNT) de negativos (NP-). A Figura 03 apresenta os dados do sensor eletroquímico, onde, após o tratamento de um minuto com pools de saliva negativa (NP-) e positiva (PNT) para TB, a ligação de IgA nos alvos imobilizados aumentou a resistência com consequente queda da corrente, com mínimo deslocamento do potencial (TBC10: 0,07V; TB2C10: 0,03V). A interação do bioeletrodo na presença de IgA negativa e positiva apresentou valores de Δipa de 12,216µA para TBC10 e 9,299µA para TB2C10, o que indica que o
sistema discrimina o alvo positivo do alvo negativo.
Figura 03: Sensor Eletroquímico. Detecção por voltametria de pulso diferencial da ligação de IgA em TBC10 e TB2C10 imobilizados em eletrodos de grafite, tampão fosfato 0,1M foi usado como eletrólito (pH 7,4). Em verde valores da corrente em eletrodo vazio, azul os valores após imobilização do alvo e tratamento com pool de saliva NP-, vermelho os valores após imobilização do alvo e tratamento com pool de saliva PNT.
Seleção de scFv
Foi possível selecionar e expressar fragmentos de anticorpos do tipo scFv ligantes de proteínas de Mycobacterium spp a partir do fago C10. A análise da capacidade de expressão dos fragmentos de anticorpos scFv e sua capcacidade reconhecimento do alvo (Figura 04 A e B) foi obtida para continuidade das análises. Os clones scFv que foram capazes de reconhecer o alvo também foram triados quanto à reatividade cruzada frente a outros antígenos. O clone 4B apresentou
maior afinidade ao fago C10, aos peptídeos TBC10 e TB2C10 e a proteínas de M. tuberculosis que a proteínas de Strongyloides sp (PSs), Brucella sp (PBs), Candida sp (PCs) e Escherichia coli (PEc) (Figura 04 C).
Figura 04: Reatividade dos fragmentos scFv. (A) Ensaio dot blot da expressão de clones scFv, (B) ELISA para avaliação do padrão de expressão dos clones selecionados e capacidade de reconhecimento do alvo, (C) reatividade do clone 4B ao fago (C10), aos peptídeos (TBC10 e TB2C10), a proteínas de: M. tuberculosis (PMt), Strongyloides sp (PSs),
Brucella sp (PBs), Candida sp (PCs) e Escherichia coli (PEc).
Imunocaptura e caracterização molecular de ligantes
A bandas em gel de acrilamida referem-se a extratos resultantes da imunocaptura pelo scFv, próprio scFv4B, fração antigênica de ~65kDa de ligante de scFv (MSPMT4B), e PMTA, fração do extrato proteico de M. tuberculosis utilizado para captura. O não aparecimento de banda de ~65kDa na coluna referente ao extrato proteico (15µL do extrato total) deve-se à baixa concentração desta proteína no extrato total, que por ter sido concentrada na imunoprecipitação (15µL de um concentrado de 1,0 mL) aparece de forma singela na segunda coluna à esquerda do marcador (MSPMT4B) (Figura 05 A). A predição da estrutura tridimensional da molécula do scFv 4B, com a identificação das regioes CDR (Figura 05 B) e da associação com a molécula chaperonin60.2 - hsp65 de Mycobacterium tuberculosis (Figura 05 C).
Figura 05: Caracterização molecular de ligantes. (A) Gel SDS PAGE com as bandas da moléculas
scFv 4B (~28kDa), fração proteica imunocaptura pelo scFv (MSPMT4B) ~65kDa, e extrato proteico de M. tuberculosis (PMTA) ~30kDa. (B) Estrutura tridimensional o scFv 4B com suas cadeias leve (amarelo) e pesada (verde) e as regiões de CDR, (B1) scFv 4B visão frontal, (B2) visão apical scFv 4B. (C) Interação entre o scFv 4B e a proteína chaperonin60.2/hsp65 de M. tuberculosis com destaque pra os aminoácidos de ligação.
Discussão
Os biomarcadores, analisados neste trabalho, apresentam potencial para utilização em diagnóstico de tuberculose, através da saliva, o que representaria um grande avanço, tanto pela viabilidade técnica amostral quanto pela praticidade e custo acessível do ensaio. A saliva já utilizada em diagnósticos de outras doenças é uma amostra promissora pelo fato da coleta não especializada, indolor e não invasiva. Soma-se ainda a vantagem da boa representatividade do estado de saúde do indivíduo. A Imunoglobulina A produzida e seccretada por células da mucosa tem papel preponderante na imunologia de mucosa e agem inibindo a adesão de microorganismos (TJÄRNLUND, 2005). A IgA um importante marcador de infecção capaz de reconhecer principalmente componentes do envoltório celular das bactérias. Cerca de 85% dos anticorpos presentes na saliva são do tipo IgA (VAN
NIEUW AMERONGEN; BOLSCHER; VEERMAN, 2004). Devido a estas características a IgA é um importante marcador para o diagnóstico da tuberculose, cuja via de infecção é a mucosa.
Os peptídeos TBC10 e TB2C10 foram capazes de detectar IgA específica de
M. tuberculosis na saliva com sensibilidade de 94,12% e especificidade superior a
76%, e foram aplicáveis na utilização em biossensor para detecção de IgA de TB. A eficiência da detecção de IgA na saliva, pode ser confirmada pela quantificação de IgA total presente na mesma quantidade de saliva usada na reação enzimática. Os valores obtidos dos dois testes mostraram que todos os indivíduos (casos e controles) apresentaram valores semelhantes para IgA total. O maior percentual de IgA específica em indivíduos positivos para Tb que os demais grupos, o grupo NP+ (PPD+) apresentou um discreto aumento no percentual de IgA, o que nos permite inferir a possibilidade de uma infecção controlada ou de contato recente com o bacilo, e sugere ampliação do estudo com maior número de amostras bem definidas com relação ao estágio da infecção, para validação da hipótese de serem aplicáveis também para diagnóstico de LTBI (Figura S02).
A duplicação do motivo proteico em TB2C10 não apresentou diferenças significativas, os peptídeos TBC10 e TB2C10 apresentaram correlação (Figura S03) muito semelhante com o fago C10 (valor de r=0,94). As análises estruturais sugerem que o enovelamento da molécula faz com que haja sobreposição dos epítopos reconhecidos pela IgA, por esta razão, a duplicação do motivo proteico não ampliou a resposta da captura do anticorpo.
A caracterização dos peptídeos permitiu, a partir do fago C10 (que originou a sequência peptídica), selecionar anticorpos que reconheceram além dos fagos, os peptídeos derivados do fago e também proteínas de M. tuberculosis, evidenciando a complementariedade dos ligantes, assim como a fidelidade da conformação das moléculas miméticas entre si.
A proteína de M.tuberculosis, ligante de IgA, que foi reconhecida pelo scFv 4B, foi imunocapturada, mas devido a quantidade muito pequena, e dificuldade na obtenção da fração proteica utilizada, ainda não foi possível a identificação da mesma por espectrometria de massas, razão pela qual a caracterização foi realizada
in silico. O processamento do extrato proteico foi realizado incluindo uma etapa de
choque térmico e gradiente de centrifugação que permite a precipitação de proteínas de citoplasma ou com capacidade de atravessar a membrana celular. Pelas
características do processo de extração proteica e pelo aparecimento da banda em gel de proteína de ~65KDa, supomos que o scFv4B pode reconhecer a proteína
hsp65 - Mycobacterium tuberculosis, chaperonin60.2.
TBC10 e TB2C10 apresentam potencial para diagnóstico em saliva, com utilização e testes rápidos, simples de baixo custo. Os biomarcadores são miméticos a proteínas antigênicas, e devem ser avaliados quanto ao potencial terapêutico e vacinal.
Materiais e métodos
Caracterização da amostra
Foram analisadas 59 amostras, agrupadas de acordo com o diagnóstico para TB, tempo de tratamento e reatividade ao teste tuberculínico, PNT, indivíduos com diagnóstico positivo para tuberculose no início do tratamento, PT, indivíduos com diagnóstico positivo para tuberculose, em percurso de tratamento (01 a 06 meses de tratamento), NP+, indivíduos aparentemente saudáveis, reativos ao teste de PPD e NP-, indivíduos aparentemente saudáveis, não reativos ao teste de PPD, conforme Tabela 01.
Tabela 01: Dados demográficos das amostras
Sintese química dos peptídeos
Uma seleção prévia por phage display permitiu obtenção e caracterização do fago M13 com peptídeo de 12 aminoácidos (C10), mimético de proteínas de Mycobacterium tuberculosis, ligante de IgA de saliva de indivíduos com diagnóstico de TB. Com base no mesmo motivo proteico, dois peptídeos, TBC10 e TB2C10, foram sintetizados com acoplamento de BSA (Soro Albumina Bovina). Para o peptídeo TB2C10 duplicou-se o motivo proteico.
PNT PT NP+ NP- Pacientes (n) 17 19 10 13 41 58 39.5 31 (35 - 58) (43 - 64) (32 - 49) (23,5 - 42) Sexo (Masc/Fem) 11/06 16/10 09/01 08/05 Sítio da Infecção (TBP/TBEP*) 12/05 08/03 - - Idade (anos)
Obtenção de Extrato Protéico de Mycobacterium tuberculosis
O extrato protéico de micobactérias foi obtido a partir de cultura de Mycobacterium tuberculosis inativadas por choque térmico com 3 ciclos de fervura por 15 min e banho em gelo por 5 min. As células foram suspensas em 1,5 mL de Tampão Salino Fosfato (PBS), e submetidas a sonicação (20 ciclos de 5 min) com resfriamento em gelo. Esta suspensão foi centrifugada a 10.000 g por 17 min a 4ºC, o sobrenadante contendo proteínas solúveis foi transferido para outro tubo e armazenado a -80ºC e o sedimento foi novamente ressuspenso em 1,0 mL de PBS, e centrifugado a 1.000 g por 10 min a 4ºC, o sobrenadante foi transferido para outro tubo e o sedimento ressuspenso em 500μL de PBS, ambos armazenados a -80ºC.
Imunoensaios
Para detecção de IgA específica, os peptídeos (0,5 µg/poço) e o fago C10 (1010 partículas virais/poço) foram imobilizados com tampão Bicarbonato (0.06 M, pH 9.6) em placas de microtitulação (Nunc Immuno MaxiSorp, Roche Diagnostics) e incubadas a 4ºC overnight. As placas foram lavadas com tampão PBS acrescido de 0,05% de Tween (PBST 0,05%), bloqueados com PBS-BSA 5%, tampão PBS acrescido de 5% de BSA, por 1 hora a 37ºC. Lavadas com PBST 0,1% e acrescentou-se 50 µL de saliva diluída 1:10 em PBS-BSA 5%, incubou-se a 37°C por 01 hora, (para detecção de IgA total, 50 µL de saliva diluída 1:10 em tampão bicarbonato foram usados para sensibilizar, seguindo o mesmo protocolo de ELISA) lavou-se por 6 vezes com PBST 0,05%. Com a adição de anti-IgA/humana HRP(peroxidase humana), 01 hora a 37ºC. Novamente lavadas 6 vezes com PBST 0,05%. A reação foi revelada pela adição de OPD (orthophenylenediamine) diluído em tampão citrato-fosfato (0,1 M, pH 5.0) e 3% de H2O2. A reação foi interrompida pela adição de 25 µL ácido sulfúrico 2,0 N. A leitura da absorbância foi realizada a 492 nm em leitor de microplacas (Multiskan Go/Thermo Scientific,Finland).
Para avaliar a expressão de scFv, uma placa de microtitulação (Nunc Immuno
MaxiSorp, Roche Diagnostics) foi sensibilizada com 50 µL de sobrenadante de
cultura diluídos 1:2 em tampão bicarbonato (0.06 M, pH 9.6), 01 hora a 37ºC, lavada com PBST 0,05%, bloqueio PBS-BSA 5%, 01 hora a 37ºC. Após a incubação e lavagem adicionou-se anti-HA / peroxidase (Roche, Basel, Suíça) diluído a 1:1000 em PBS-BSA 5%, 01 hora a 37ºC, 6 lavagens com PBST 0,05%. A reação foi
revelada OPD e interrompida pela adição de 25 µL ácido sulfúrico 2 N. A leitura da absorbância foi realizada a 492 nm em leitor de microplacas (Multiskan Go/Thermo
Scientific,Finland).
Para avaliar o reconhecimento do scFv a proteínas e peptídeos, foram utilizados para sensibilizar placas de microtitulação (Nunc Immuno MaxiSorp, Roche
Diagnostics) 1010 partículas virais/poço de fago C10 e 1,0 µg/poço de TBC10, TB2C10 e extrato proteico de M.tuberculosis, Strongyloides sp., Brucella sp.,
Candida sp., e Escherichia coli, incubando a 4ºC overnight. As etapas de bloqueio,
lavagem, adição de anticorpo primário (scFv) e secundário (anti-HA) e incubação seguiram o protocolo anterior. A reação foi revelada pela com OPD e interrompida com ácido sulfúrico 2N. A leitura da absorbância foi realizada a 492 nm em leitor de microplacas (Multiskan Go/Thermo Scientific,Finland).
Dot blot scFv
O ensaio dot blot foi realizado adicionando-se 10 μL de scFv purificado a tiras de membrana de nitrocelulose 0,45 μM (GE Healthcare Life Sciences, Waukesha,
WI, USA). Bloqueio com PBS/BSA 5%. Adicionou-se anti-HA/peroxidase (Roche,
Basel, Suíça). A reação foi revelada pela adição do substrato DAB (3,3'- diaminobenzidina) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, EUA).
Sensor eletroquímico
As medidas de foram realizadas utilizando um potenciostato portátil PalmSens conectado a um computador intel core i7, Windows 10. Todas as medições foram realizadas à temperatura ambiente (25ºC). Eletrodos de carbono Ds dropsens Drp-
110 (DropSens, S.L. Oviedo,Espanha) foram utilizados para imobilizar 5 ng em 4 µL
de tampão fosfato 0,1M, pH 7,4, bloqueados com tampão fosfato acrescido de 0,5% de BSA. Após secagem completa, foi adicionado 4 µL de pool saliva diluída 1:10 em tampão fosfato, após um minuto de reação a superfície foi lavada por três vezes com água ultrapura. Após a secagem. A leitura foi realizada utilizando solução de ferro/ferricianeto de potássio 5,0mM com 0,1M de KCl.
Seleção e caracterização de moléculas de scFv
A seleção de clones de scFv frente ao fago C10 foi realizada utilizando uma biblioteca de fagos contendo aproximadamente 2x106 sequências combinatórias de
scFv, desenvolvida por CARNEIRO (2010) no Laboratório de Nanobiotecnologia da UFU e já utilizada frente a diversos alvos (ARAÚJO et al., 2014; LEVENHAGEN et
al., 2015)
Foram realizados dois ciclos de seleção, sendo precedidos pela reamplificação da biblioteca de scFv em Escherichia coli XL1-Blue competentes e infecção do fago auxiliar VCSM13 para a montagem e replicação das proteínas virais (BARBAS III et al., 2001). Um poço de uma placa de microtitulação (Nunc
MaxiSorpTM, eBioscience, San Diego, CA, EUA) foi sensibilizado com 1010
partículas virais em 50μL/poço em tampão carbonato-bicarbonato 0,1M (pH 8,6) e incubado por 18 horas a 4°C. O poço foi bloqueado com 250 μL de PBST 0,05%/BSA 5% durante 1 hora a 37°C, e lavado três vezes com PBS. Em seguida, 100 μL da biblioteca de fagos-scFv foram adicionados ao poço e a placa foi incubada por 1 hora a 37°C. Posteriormente, o poço foi lavado 10 vezes com PBST 0,1%. Os fagos ligados às proteínas totais foram eluídos com 100 μL de glicina-HCl 100mM (pH 2,2) durante 30 minutos à temperatura ambiente (TA). A suspensão foi neutralizada com 16,5 μL de Tris 2M (pH 9,1). Os fagos resultantes desta primeira seleção foram amplificados em E. coli XL1-Blue.
Extração do DNA plasmidial e transformação em E. coli TOP10
Bactérias E. coli XL1-Blue infectadas a partir do 2º ciclo de seleção foram utilizadas para extração do DNA plasmidial e posterior transformação em bactérias
E. coli TOP10, uma linhagem não supressora. A extração DNA plasmidial foi
realizada utilizando o QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden, DS, Germany), de acordo com as instruções do fabricante. O DNA plasmidial extraído foi quantificado (Nanodrop Spectrophotometer, (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EUA) e posteriormente analisado em gel de agarose a 0,8%. Bactérias E. coli TOP10 foram preparadas com CaCl2 para se tornarem quimiocompetentes. Aproximadamente 50 ng de DNA plasmidial foram adicionados cuidadosamente em 10 μL bactérias