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O ensaio do cometa é uma técnica que permite detectar lesões transitórias no DNA (RIBEIRO; SALVADORI; MARQUES, 2003) que podem ser reparadas ou resultarem em

mutação gênica (PFUHLER et al., 2011). Ao microscópio, a imagem resultante deste teste lembra a figura de um cometa, com uma cabeça distinta e uma cauda proeminente, sendo que a cabeça é composta por DNA intacto e, a cauda, por fragmentos de DNA (KASUBA et al., 2012). Tice; Andrews; Singh (1990), Olive; Wlodeck; Babáth (1991) e Matsumoto et al. (2006), têm mostrado que a sensibilidade do ensaio do cometa em detectar danos no DNA é compatível com outros métodos de avaliação para vários agentes.

A primeira versão do ensaio do cometa foi realizada em pH neutro por Ostling e Johanson em 1984. Neste pH, somente quebras de fita dupla podiam ser detectadas. Em 1988, Singh et al. introduziram a versão alcalina do cometa (pH > 13), permitindo a detecção de quebras de fita simples, sítios álcali-lábeis e crosslinks DNA-DNA e DNA-proteínas, em células individuais. Como a maioria das lesões induzidas pelos agentes genotóxicos são quebras de fita simples e/ou sítios álcali-lábeis, a versão alcalina do ensaio do cometa oferece uma maior sensibilidade na identificação de agentes genotóxicos (TICE et al., 2000). Esta nova versão do ensaio tornou-se uma ferramenta muito utilizada na área da genética toxicológica (FAUST et al., 2004), possibilitando a avaliação de danos genéticos in vivo e in vitro em uma grande variedade de células (ROJAS; LOPEZ; VALVERDE, 1999, TICE et al., 2000, KASSIE; PARZEFALL; KNASMÜLLER, 2000, PANDEY et al., 2009).

O ensaio do cometa não detecta mutações e sim danos no DNA que podem ou não resultar em mutações, após serem processadas pelas enzimas de reparo (GONTIJO; TICE, 2003).

Basicamente, a técnica do cometa consiste em embeber uma suspensão celular em gel de agarose sobre uma lâmina, lisar as células por meio de detergentes e soluções salinas em altas concentrações, e tratá-las com soluções alcalinas para permitir o desenovelamento do DNA e a liberação dos fragmentos existentes que migrarão para o pólo positivo, durante a eletroforese. Após a eletroforese, as lâminas são mergulhadas em solução de neutralização e em seguida, coradas com corantes fluorescentes que se ligam ao DNA, como o brometo de etidio (FAUST et al., 2004).

Na lise celular, as membranas (citoplasmática e nuclear), o citoplasma e o nucleoplasma são removidos, os nucleossomos são desfeitos e quase todas as histonas são solubilizadas. O que resta das células é chamado de nucleóide e consiste de uma matriz nuclear composta de DNA, RNA e proteínas (COLLINS, 2004). Durante a eletroforese (em pH alcalino), os fragmentos de DNA diretamente induzidos pelos agentes genotóxicos ou formados por sítios de reparo transitórios (MOLLER, 2006), migram para o pólo positivo da cuba, devido a sua carga negativa. Quando submetido à eletroforese, a aparência do nucleóide

assemelha-se a de um cometa, apresentando uma cabeça (onde encontra-se o DNA não lesado) e uma cauda (formada pelos fragmentos de DNA arrastados para o ânodo durante a eletroforese) (TICE, 1995).

A análise das lâminas do cometa pode ser feita visualmente ou por meio de softwares de análise de imagem. A análise visual pode ser feita de quatro maneiras distintas: a. contabilização de nucleóides com e sem cauda; b. classificação dos nucleóides em classes de migração (de 0 a 4 ou de 1 a 5, sendo que o “0” ou o “1” representam ausência de danos e o “4” ou “5” representam a quantidade máxima de danos induzidos) e obtenção de escore (multiplicação do número da classificação do cometa pela quantidade de cometa em cada classe); c. comprimento do cometa ou da cauda (com auxílio de uma régua ocular acoplada ao microscópio ou de fotografias para análise); d. razão do comprimento do cometa pelo diâmetro perpendicular da cabeça do cometa. Por meio de analisadores de imagem, os cometas podem ser analisados também de quatro maneiras distintas: a. comprimento do cometa ou da cauda; b. porcentagem de DNA na cauda; c.tail moment (ou momento da cauda), que é uma relação entre o comprimento da cauda e a quantidade (%) de DNA que migrou; d. área do cometa (GONTIJO; TICE, 2003).

Quanto maior os danos induzidos no DNA analisado, maior é a cauda do cometa. Assim, células apresentando nenhum ou pouco dano apresentam similaridade com os nucleóides, ou seja, ausência de cauda (TICE, 1995). Quando a migração do DNA é reduzida, ocorrendo em níveis menores do que o observado para o controle negativo, pode-se deduzir que houve indução de crosslinks (lesões relacionadas a eventos de mutagênese). Quando a migração do DNA é elevada, pode-se deduzir que houve indução de quebras na fita do DNA ou de sítios álcali-lábeis. Ainda, eventos de reparo do DNA por excisão de bases também podem resultar em elevada migração do DNA (BRENDLER-SCHWAAB et al., 2005).

Células mortas ou em processo de morte apresentam uma imagem típica no ensaio do cometa. Estas células resultam em cometas com uma cabeça pequena ou inexistente e uma cauda grande e difusa, contendo quase todo o DNA do nucleóide (BRENDLER-SCHWAAB et al., 2005).

O ensaio do cometa é uma técnica rápida e sensível para detecção de danos primários no DNA. Comparado com outros testes de genotoxicidade, o teste do cometa apresenta vantagens pelo curto período de tempo necessário para concluir o experimento, pela necessidade de um pequeno número de células por amostra e pela sensibilidade na detecção de baixos níveis de danos no DNA (TICE et al., 2000). Ainda, a análise dos danos no DNA é

menos subjetiva do que as de outros ensaios de genotoxicidade, tem alto poder estatístico e pode ser automatizada (LEE; KWON; CHUNG, 2003).

Apesar destas vantagens, este teste não detecta danos como aneuploidia, rearranjos cromossômicos, mau-reparo do DNA ou adutos de DNA (LEE; KWON; CHUNG, 2003). Os danos primários detectados podem, também, ser corretamente reparados e não resultarem em alterações genéticas permanentes (BRENDLER-SCHWAAB et al., 2005). Contudo, as lesões detectadas pelo ensaio do cometa, por serem lesões iniciais induzidas por agentes genotóxicos, fazem com que este ensaio seja cada vez mais utilizado como um biomarcador de exposição (LEE; KWON; CHUNG, 2003).

Algumas aplicações do ensaio do cometa incluem o monitoramento ecológico (por meio da utilização de organismos biosensores como, por exemplo, os mexilhões, as minhocas e pequenos roedores), testes de triagem química e estudos em humanos (biomonitoramento, estudos nutricionais e diagnóstico de doenças genéticas) (COLLINS, 2004). Segundo Hartmann et al. (2003), o ensaio do cometa é considerado um teste padrão dentre a bateria de testes utilizados para avaliar a segurança de novos medicamentos ou outros químicos.

Ainda, segundo Moller (2006), o ensaio do cometa tem sido aplicado no estudo da genética toxicológica, da ecotoxicologia, do reparo do DNA e da apoptose. De acordo com este mesmo autor, novas aplicações do ensaio do cometa incluem a detecção de crosslinks DNA-DNA e de danos em genes específicos, por meio da técnica de hibridização in situ fluorescente (cometa-FISH). Além disso, uma modificação no ensaio do cometa pode ser realizada para medir a atividade de reparo em células portadoras de lesões oxidativas no DNA.

A introdução de enzimas que reconhecem um tipo particular de dano, torna o ensaio do cometa uma técnica mais específica e sensível. Enzimas como a endonuclease III, a formamidopirimidina DNA glicosilase (FPG), a T4 endonuclease V e a Alk A são exemplos de proteínas que atuam em locais específicos do DNA, causando quebras adicionais e aumentando a intensidade da cauda do cometa. Particularmente, a endonuclease III e a FPG são enzimas utilizadas com frequência para detecção de danos oxidativos no DNA (COLLINS, 2004). A atuação enzimática ocorre logo após a lise celular. A enzima é colocada sobre a lâmina contendo os nucleóides embebidos em agarose e incubada na temperatura ótima da enzima (GONTIJO; TICE, 2003).

Uma vez que as quebras detectadas pelo ensaio do cometa normalmente são reparadas em um curto período de tempo antes de se fixarem como uma mutação, recomenda-se que

outros testes bem estabelecidos sejam realizados juntamente com este ensaio, para a determinação dos efeitos genotóxicos de um determinado composto (FAUST et al., 2004).