Kapittel 5 – Norges tilpasning i EØS – saker
6.1 Norges innflytelse under utarbeidelsen av nye rettsakter
4.7.1 Ativação dos transientes de Ca2+
Os transientes de Ca2+ foram induzidos por: 1) estimulação de campo (39 V, 2ms)
através de eletrodos de platina dispostos ao longo do sistema de perfusão (estimulador celular MyoPacer, IonOptix, EUA) ou 2) pulsos de voltagem ou injeção de corrente, ambos aplicados com o uso da técnica de patch clamp na sua configuração whole-cell. Todos os experimentos foram realizados em células perfundidas (~1 mL/min) com solução de Tyrode aquecida entre 35 a 37 oC. O aquecimento foi realizado com o auxilio de uma resistência montada em um sistema
de serpentina metálica por onde a solução de perfusão percorria, através de um tubo de plástico, antes de alcançar as células. A temperatura do resistor, e consequentemente da solução de Tyrode, foi controlada através quantidade de corrente injetada no circuito por meio de uma fonte de corrente contínua, sendo periodicamente monitorada com o uso de um termistor. O protocolo de pulsos, quer para os experimentos com estimulação de campo, quer para aqueles com uso da técnica de patch clamp, foi programado com a ajuda do software Clampex 8.0 (Molecular Device, EUA).
4.7.2 Restituição da amplitude do transiente citosólico de Ca2+
Antes de iniciar o registro de 3 transientes em sucessão, 9 pulsos (aqui chamados de pré-pulsos, 2 Hz) foram aplicados para que o conteúdo de Ca2+ do RS alcançasse um estado de
equilíbrio. Os estímulos responsáveis por evocar os transientes registrados, após a sequência de pré-pulsos, foram, apenas para fins didáticos, nomeados cronologicamente de S1, S2 e S3. O
intervalo inicial entre esses estímulos foi de 500 ms. Para a obtenção da curva de restituição da amplitude do transiente de Ca2+, o intervalo entre S
1 e S2 foi gradativamente reduzido a passos
de 50 ms em cada repetição experimental. Foram então medidas as amplitudes dos transientes evocados pelos estímulos S1 (A1) e S2 (A2). Após isso, a amplitude relativa segundo transiente
(A2/A1) foi plotada em função do intervalo entre os estímulos (S2 - S1).
4.7.3 Restituição da amplitude da corrente de Ca2+ do tipo L
De modo semelhante ao protocolo de restituição da amplitude do transiente de Ca2+, o
frequência constante de 2 Hz, sendo posteriormente registrada a ICa,L evocada por 2 pulsos
despolarizantes em sequência. Os pulsos foram nomeados de P1 e P2, com intervalo de 500 ms
entre si. Posteriormente, o intervalo entre P1 e P2 foi gradativamente reduzido a passos de 50
ms, em cada repetição experimental. Para se obter as curvas de restituição da ICa,L, foram
medidas a amplitude da ICa,L evocada pelos pulsos P1 (A1) e P2 (A2). Após isso, a amplitude
relativa da segunda corrente (A2/A1) foi plotada em função do intervalo de tempo entre os
pulsos. Os transientes de Ca2+ foram registrados simultaneamente à I Ca,L.
A solução de pipeta utilizada nesses experimentos teve a seguinte composição (em mM): 110 CsOH, 110 ácido aspártico, 10 NaCl, 20 cloreto de tetraetilamônio (TEA-Cl), 10 HEPES, 5 ATP-Mg e 0,05 Fluo5-F 5K (pH ajustado para 7,2 adicionando-se CsOH a 1,0 M). O potencial de junção foi estimado (aproximadamente -10 mV) com a ajuda do software Clampex 8.0 (Molecular Device, EUA), de modo que todos os valores de potencial de membrana, aqui apresentados, já se encontram corrigidos. As células foram mantidas a um potencial de holding de -80 ou -50 mV. Para evocar a ICa,L sem que se observasse uma corrente de calda ao fim do
pulso despolarizante, as células foram rapidamente despolarizadas para 0 mV, por 15 ms e, logo em seguida, uma rampa de 15 ms retornava o potencial de membrana para os valores de
holding. Em alguns experimentos, cujo o potencial de holding era mantido a -80 mV, foi utilizado tetrodotoxina (100 M) com o intuito de bloquear as correntes de Na+ nos cardiomiócitos.
4.7.4 Restituição da amplitude e duração do potencial de ação
Para realização do protocolo de restituição da amplitude e duração do PA, o conteúdo de Ca2+ do RS foi normalizado através da aplicação de 9 pré-pulsos à uma frequência
constante de 2 Hz, sendo posteriormente registrados 2 PAs em sequência, todos eles estimulados pela injeção de 2nA de corrente, por 2ms. Esses estímulos foram nomeados de S1
e S2, com intervalo de 500 ms entre si. Posteriormente, o intervalo entre S1 e S2 foi
gradativamente reduzido a passos de 50 ou 10 ms em cada repetição experimental. Para se obter as curvas de restituição da amplitude e duração do PA, essas variáveis foram medidas em ambos, no primeiro e no segundo PA. Após isso, a amplitude relativa e o tempo necessário para que 50 % da repolarização fosse alcançada (RT50) foram plotadas em função do intervalo de
tempo entre os PAs. Os transientes de Ca2+ foram registrados simultaneamente.
A solução de pipeta utilizada nesses experimentos teve a seguinte composição (em mM): 11 KCl, 120 K-aspartato; 5 NaCl; 0,5 MgCl2; 10 HEPES, 5 ATP-Mg; 0,5 Mg-GTP; 0,05
mantidas a um potencial de holding de -90 mV, através da injeção contínua de -50 a -150 pA. A amplitude e a duração do PA foram analisadas com o auxílio do software Clampfit 10 (Molecular Devices, EUA). O potencial de junção foi estimado (aproximadamente -10 mV) com a ajuda do
software Clampex 8.0 (Molecular Device, EUA), sendo levado em consideração na construção do protocolo experimental.
4.7.5 Medida da carga total de Ca2+ no retículo sarcoplasmático
Como previamente descrito por Varro et al. (1993), a carga total de Ca2+ do RS foi
estimada pela integração da área da corrente de NCX, evocada durante a rápida exposição das células à solução de Tyrode contendo 10 mM de cafeína, por 10 s. As células foram rapidamente expostas à cafeína através de uma pipeta de perfusão controlada por uma bomba pneumática (WPI, EUA), que por sua vez era comandada pelo software Clampex 8.0. Somente foram utilizadas células que apresentavam valores de carga total de Ca2+ semelhantes em pelo
menos 2 aplicações consecutivas, separadas por um intervalo de 3 minutos entre si. Todas as medidas de NCX foram realizadas com a mesma solução interna utilizada para registro da ICa,L.
Em todos experimentos uma sequência de pré-pulsos (9 pulsos, 2Hz) foi aplicada com o intuito de manter os níveis de [Ca2+]
RS em um estado de equilíbrio. 500 ms após o último pré-pulso as
correntes de NCX eram evocadas e registradas a -80 mV. A integração da área das correntes foi realizada com o auxílio do software Clampfix 10.0 (Molecular Device, USA). Os valores de carga total de Ca2+ do RS foram expressos em mol de Ca2+ por litro de citosol.
4.7.6 Efeito de inibidores da SERCA na restituição da amplitude do transiente de Ca2+
Foram utilizados tapsigargina (60 nM) ou ácido ciclopiazônico (CPA, 2M), ambos bloqueadores clássicos e seletivos da SERCA, para avaliar o efeito da redução da recaptação do Ca2+ pelo RS no curso temporal da restituição da amplitude do transiente de Ca2+ em
experimentos de estimulação de campo. Ambas drogas foram solubilizadas em DMSO, sendo que a concentração final desse último não ultrapassou 0,01 % nos experimentos. A mesma quantidade de DMSO foi adicionada à solução controle para evitar erros na interpretação dos dados. Nesse protocolo também foi avaliado o efeito dessas drogas no pico e no decaimento do transiente de Ca2+. Além disso, foram também investigadas as alterações na carga de Ca2+ do
4.7.7 Efeito de moduladores dos RyRs na restituição da amplitude do transiente de Ca2+
Foram utilizadas cafeína e tetracaína como ferramentas farmacológicas para aumentar ou reduzir, respectivamente, o estado de ativação dos RyRs. Deste modo, protocolos de restituição da amplitude do transiente de Ca2+ foram realizados na presença e na ausência
dessas drogas. O efeito de 100 ou 500 M de cafeína foi estudado em células sob estimulação de campo na ausência ou na presença dessa droga (entre 2 a 4 minutos de exposição). O efeito da tetracaína foi investigado em células submetidas à estimulação através da pipeta de patch
clamp, na ausência e na presença de 100 M da mesma. Essas drogas foram solubilizadas em água ultrapura momentos antes dos experimentos. Nesse protocolo, também foram avaliados o efeito dessas drogas no pico e no decaimento do transiente de Ca2+. Além disso, foram
investigadas as alterações no conteúdo total de Ca2+ do RS induzidas por tais substâncias.
4.7.8 Papel do conteúdo total de Ca2+ do retículo sarcoplasmático na restituição da amplitude
do transiente de Ca2+
Neste protocolo buscou-se avaliar se a carga total de Ca2+ do RS é intensamente
alterada após uma CICR. Para tanto, o conteúdo total de Ca2+ do RS foi medido em 3 diferentes
intervalos de tempo após um transiente induzido. Praticamente o mesmo protocolo empregado no subitem "Medida da carga total de Ca2+ no retículo sarcoplasmático" foi utilizado, a única
diferença aqui baseou-se na rápida perfusão da solução de Tyrode contendo cafeína a 10 mM em três diferentes intervalos de tempo após uma CICR, a saber: 500, 200 ou 110 ms, respeitando um intervalo de 3 minutos entre cada repetição experimental a fim de restaurar plenamente os estoques de Ca2+ do RS. É valido ressaltar que nesse trabalho foi observado um
atraso de aproximadamente 70 ms entre o inicio da perfusão da solução contendo cafeína e o inicio da INCX. Esse atraso foi corrigido durante a execução do protocolo. Somente foram
utilizadas células que mostravam valores de carga total de Ca2+ semelhantes em pelo menos 2
aplicações consecutivas, separadas por um intervalo de 3 minutos.