National regulatory procedures

As espécies identificadas pela identidade genômica da região ITS1-5,8S-ITS2 são relacionadas na Tabela 21, e suas respectivas seqüências (estado original) encontram-se depositadas no Instituto Biológico juntamente com os registros de coleta.

O procedimento de identificação, através de consulta informatizada, tem se mostrado bastante eficiente, prático e rápido do ponto de vista operacional. Entretanto, como ferramenta para esclarecer fenômenos biológicos, deve ser considerado com muita cautela.

A caracterização taxonômica, a partir de dados moleculares apresenta algumas restrições tornando sua análise relativamente complexa. O mecanismo de busca do programa BLASTN, que opera integrado ao GenBank e faz sua análise mediante algoritmos de similaridade, é um sistema dinâmico e integrado, dependente dos dados inseridos como conjunto. Desse modo, alguns pontos devem ser evidenciados e considerados na análise dos dados obtidos:

1) a relação entre os caracteres morfológicos e os caracteres moleculares ainda não está inteiramente elucidada. Apesar da existência de certas regiões gênicas informacionais e correlacionadas com determinadas expressões fenotípicas, portanto taxonômicamente relevantes, estas regiões ou genes podem estar atuando de modo dependente, sofrendo efeitos de mecanismos regulatórios paralelos e não conhecidos (ou não associados). Assim, sob certas cirscunstâncias de interação a determinada seqüência ou gene pode apresentar correlação positiva temporária com o caracter estudado, originando inferências plausíveis tecnicamente mas não constantes.

2) No caso de regiões muito conservadas, como aquela utilizada, a questão levantada é até que ponto a baixa variabilidade pode se traduzir numa divergência que, correlacionada com sua morfologia, que permita o agrupamento em classes distintas;

3) A caracterização das diversas classes biológica ainda é um ponto debatido intensa e extensivamente no meio acadêmico. O próprio conceito de espécie vem sendo

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questionado à luz, não somente da relação morfológica x molecular, como também morfológica x funcional.

4) Em termos operacionais o GenBank, se por um lado apresenta a vantagem de operar abertamente, por outro os materiais depositados provenientes de diferentes partes do mundo, não recebem qualquer tipo de conferência teórica (apenas o preenchimento de questionário de parâmetros mínimos para viabilizar o depósito). As informações são incluídas, portanto, no banco de dados e colocados na rede, segundo informação do próprio autor o qual se responsabiliza por sua eventual atualização e/ou correção.

Como o critério de análise do BLASTN é feito por comparação em conjunto, de todas as seqüências depositadas, fica claro que qualquer depósito, tenha sido sua identificação a priori adequada ou não, provocará um novo balanceamento em todo o sistema. Assim, esse novo balanceamento poderá trazer conseqüências críticas nas análises seguintes, em casos até invalidando inferências anteriores.

5) Outra questão que se coloca, decorrente da anterior, é o caráter cumulativo e residual das seqüências que vão se depositadas. A ausência de um sistema de atualização dos dados submetidos, ou mesmo uma “limpeza”, futuramente poderá gerar diversas controvérsias.

6) Ainda sobre as seqüências depositadas, outro fator que pode influir no resultado da pesquisa é a prévia manipulação das seqüências durante a etapa de alinhamento (alteração da localização de bases e/ou gaps, corte de extremidades) eventualmente mascarando informações que poderiam ser fundamentais para a análise seja taxonômica ou filogenética. Esse item, bem como a qualidade do seqüenciamento, são fundamentais, pois poderão gerar identidades artificais (escores e e-value distintos) (vide exemplos no Anexo 4).

Isso pode ser crítico para espécies muito próximas como é o caso de T.

asperellum e T. harzianum. No caso específico de T. asperellum, como sua descrição é

recente (SAMUELS et al., 1999), as seqüências depositadas até então podem corresponder a qualquer uma das duas (a julgar apenas pela sua identificação de submissão).

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Portanto, as espécies descritas como entidades biológicas distintas (espécies), fundamentadas em caracteres morfológicos, molecularmente, pela região do DNA analisada, podem vir a ser consideradas como pertencentes à mesma espécie.

Pelos dados obtidos isso não parece ser uma regra para todas as espécies identificadas. Espécies como T. stromaticum e T. longibrachiatum foram identificadas com relativa precisão, enquanto outras como T. album; T. citrinoviride; T. erinaceum,

T. ghanense, e T. saturnisporum precisam ser melhor estudadas.

Sobre as seqüências depositadas no GenBank, também é importante considerar que nem todas as espécies citadas foram descritas até a presenta data. Várias delas, como por exemplo Trichoderma rossicum, T. taiwanense, T. strigosum, T. virgatum, T.

effusum e outras, ainda não tiveram suas descrições publicadas (trabalhos não

publicados, ou submetidos), portanto ainda não podem ser consideradas como espécies válidas pela comunidade acadêmica.

No Anexo 6, são relacionadas as “espécies” (sic) que possuem seqüências depositadas no GenBank e outras relações de espécies consideradas válidas por autores diferentes. Pode ser constatado que várias espécies não possuem exemplares (seqüências) depositados como é o caso, por exemplo de T. polysporum.

Em relação à técnicas moleculares mais específicas a metodologia de RAPD pode ser uma alternativa interessante na identificação de espécies, entretanto maiores estudos devem ser feitos para a obtenção de iniciadores (ou grupos) eficientes. Conforme observou Zimand et al. (1994), embora a técnica tenha sido adequada na distinção de isolados da mesma espécie, no caso de T. harzianum, obtiveram perfis idênticos entre 23 isolados. É importante ressaltar que T. harzianum constitui um caso atípico dentro do gênero, uma vez que se trata de uma espécie variável tanto morfologicamente como geneticamente. Este fato levou alguns autores a sugerirem o envolvimento de mais de uma espécie (GRONDONA et al., 1997). Estudos mais recentes, a partir de resultados combinados do seqüenciamento de 4 genes (CHAVERRI et al., 2003b), demonstraram que T. harzianum trata-se, na verdade, de um complexo de espécies que inclui linhagens filogenéticas crípticas morfológicas e biológicas, apresentando até mesmo número de cromossomos diferentes em alguns casos (SAMUELS, 2004).

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No caso de diferenciação de espécies muito próximas (ou mesmo linhagens) outros recursos poderiam utilizados como a análise através de RFLP desta região (GAMS & MEYER, 1998) ou ARDRA (amplified ribosomal DNA restriction analysis) (ACINAS et al., 1997). A técnica de ARDRA, entretanto, para poder ser utilizada, deve-se ter em conta a variação intra-gênica na análise dos resultados. A opção mais indicada, que poderia ser testada futuramente é a RISA (rDNA internal spacer analysis, GARCÍA-MARTINEZ et al., 1999) que utiliza os espaçadores intergênicos, os quais apresentam regiões hipervariáveis que são bastante úteis na discriminação fina de OTUs (unidades taxonômicas operacionais).

No caso do complexo Trichoderma, como estas técnicas ainda não foram testadas, é prematuro e difícil prever se poderão auxiliar de algum modo na sua elucidação, dada a artificialidade da classificação atual.