Diversos trabalhos mostram a predisposição da fase de diestro em reduzir a imunidade uterina em cadelas, demonstrando desta forma o efeito dos hormônios ovarianos na imunidade.
Tsumagari et al. (2005) relataram que o útero fica mais susceptível a E. coli inoculadas entre 11-30 dias após o pico de LH. A supressão da imunidade celular observada na primeira parte do diestro é um possível resultado das concentrações de progesterona crescentes, e a baixa nos níveis de estradiol (SUGIURA et al., 2004). Além disso, a progesterona causa um aumento na ligação da E. coli com o endométrio ( LEITNER et al., 2003; ISHIGURO et al., 2007)
Neste trabalho, assim como nos trabalhos realizados em bovinos (BORGES et al., 2012; SAUT et al., 2014) que avaliaram a expressão gênica e concentração das citocinas IL-6, IL-ip e IL-8, os explantes de endométrio intactos não foram afetados pelos estágios do ciclo do estral. A resposta à presença de LPS no cultivo estimulou a síntese e lançamento de IL6 e IL12 pelos explantes, mas não houve diferença no concentração das interleucinas entre os grupos divididos segundo a concentração de progesterona
Pelo fato de não ter se observado efeito dos níveis de progesterona sobre a resposta inflamatória endometrial após o estímulo com LPS, uma alternativa foi testar se os hormônios esteroides ovarianos poderiam regular a
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imunidade inata endometrial, por meio do tratamento prévio de explantes endometriais intactos com esteroides exógenos antes do desafio com LPS.
Nas primeiras 24 horas de exposição dos explantes endometriais intactos aos hormônios ovarianos verificou-se que os explantes acumularam mais IL6 e IL12 em resposta ao LPS e sem interferência da exposição ao estradiol e progesterona.
Após a exposição dos explantes a LPS (24-48 horas), houve resposta ao desafio com acúmulo de IL6 e IL12. Houve também efeito do prévio tratamento com progesterona ou estradiol na resposta ao LPS, onde ambos os estrógenos acumularam mais IL6 e IL12. Além disso, o tratamento prévio com dexametasona reduziu o acúmulo de IL6 após o estímulo com LPS, já para IL12 o tratamento prévio com dexametasona incrementou a resposta antes (0 24 horas) e após (24-48 horas) o estímulo com LPS.
Silva et al. (2010) relataram que ao longo do ciclo estral no endométrio canino ocorre a transcrição de genes para TLR, o que indica que a resposta imune é mediada pelos TLR, que é um componente importante dos mecanismos de defesa dentro do útero. Entretanto, no início do diestro a transcrição e expressão desses receptores diminui, fator este que favorece a implantação embrionária durante a gestação, mas pode também ser ligado à elevada prevalência de piometra nesta fase do ciclo estral.
Apesar das diferenças encontradas por Silva et al. (2010) nas fases do ciclo estral, no presente estudo observou-se que a síntese das citocinas IL-6 e 12, quando desafiado com LPS, é semelhante no endométrio canino ao longo do ciclo estral. O mesmo foi encontrado por Saut et al. (2014), em explantes de endométrio bovino previamente tratados com hormônios esteroides e desafiados com cepas de E. coli vivas e LPS tratados com hormônios exógenos, ao se avaliar a síntese das interleucinas IL-6, IL-ip e IL-8.
A respeito da resposta imune do endométrio canino, algumas questões ainda devem ser melhor avaliadas, assim como outras moléculas com efeito regulatório poderiam estar envolvidas e que, no presente estudo, não foram avaliadas. Alterações da resposta imune adaptativa teriam um efeito significativo sobre a evolução da doença, ou pode haver um efeito regulatório indireto de esteroides ovarianos sobre a imunidade inata ou adaptativa.
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6. CONCLUSÃO
Foi possível estabelecer a técnica de explantes endometriais em cadelas como um modelo experimental viável para aprofundar o entendimento da resposta imune inata uterina.
Não houve efeito do estágio do ciclo estral na resposta das citocinas ao estímulo de lipopolissacarídeos.
A adição de progesterona e estradiol previamente ao desafio por lipopolissacarídeos estimula a resposta da interleucina pró-inflamatória IL12.
A adição de dexametasona previamente ao desafio por lipopolissacarídeos inibe a resposta da interleucina pró-inflamatória IL6 e estimula a interleucina pró-inflamatória IL12.
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REFERÊNCIAS
ABBAS, A.K.; LICHTMAN, A.H.;POBER, J. S. Imunologia Celular e Molecular. (3a edição). Rio de Janeiro: Revinter, 2000.
ABOUSSAHOUD, W.; et al.. Expression and function of Toll-like receptors in human endometrial epithelial cell lines. Journal of Reproductive
Immunology, 84(1), 41-51,2010.
ALLISON, R. W.; THRALL, M. A.; OLSON, P. N.. Vaginal Citology. In R. L. Cowell & A. C. Valenciano (Eds), Cowell and Tyler’s diagnostic
cytology and hematology of the dog and cat 4a edição. Missouri: Mosby
Elsevier, 2014.p.582.
BANSAL, D.; et al. An ex-vivo Human Intestinal Model to Study Entamoeba histolytica Pathogenesis. PLoS Neglected Tropical Diseases, 8(11),
e551.2009
BIDDLE, D.; MACINTIRE, D. K. Obstetrical emergencies. Clinical Techniques
in Small Animal Practice, 15(2), 88-93, 2000.
BORGES, A. M.; HEALEY, G. D.; SHELDON, I. M. Explants of intact
endometrium to model bovine innate immunity and inflammation ex vivo.
American Journal of Reproductive Immunology, 67(6), 526-39, 2012.
BOUMAN, A.; JAN HEINEMAN, M.; FAAS, M. M. Sex hormones and the immune response in humans. Human Reproduction Update, 2005.
BRADY, C. A.; OTTO, C. M. Systemic Inflammatory Response Syndrome, Sepsis, and Multiple Organ Dysfunction. Veterinary Clinics of North
America: Small Animal Practice, 31(6), 1147-1162, 2001.
BROWNING, T. H.; TRIER, J. S. Organ culture of mucosal biopsies of human small intestine. The Journal of Clinical Investigation, 48(8), 1423-32.
1969.
CHALLIS, J. R.; et al.. Inflammation and pregnancy. Reproductive Sciences (Thousand Oaks, Calif.), 16(2), 206-15, 2009.
CHEN, G. Y.; NUNEZ, G.. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nature Reviews. Immunology, 10(12), 826-37, 2010.
CONCANNON, P. W.. Reproductive cycles of the domestic bitch. Animal Reproduction Science, 124(3), 200-210, 2011.
COOKE, P. S.; et al. Stromal estrogen receptors mediate mitogenic effects of estradiol on uterine epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 94(12), 6535-40, 1997.
CRONIN, J. G.; TURNER, M. L.; GOETZE, L.; BRYANT, C. E.; SHELDON, I. M. Toll-like receptor 4 and MYD88-dependent signaling mechanisms of the innate immune system are essential for the response to lipopolysaccharide by epithelial and stromal cells of the bovine endometrium. Biology of
39
Reproduction, 86(2), 51.2012.
CUKIERMAN, E.; PANKOV, R.; STEVENS, D. R.; YAMADA, K. M.. Taking cell- matrix adhesions to the third dimension. Science, 294(5547), 1708-12. 2001.
DAB R OWSKI, R.; WAWRON, W.; & KOSTRO, K.. Changes in CRP, SAA and haptoglobin produced in response to ovariohysterectomy in healthy bitches and those with pyometra. Theriogenology, 67(2), 321-327.2007.
D E B U E N D E A R G Ü E R O, N. Citologia diagnostica veterinaria. México: El
Manual Moderno, 2001.
DENNEY, J. M.; et al. Longitudinal modulation of immune system cytokine profile during pregnancy. Cytokine, 53(2), 170-177,2011.
DHALIWAL, G. K.; WRAY, C.; NOAKES, D. E. Uterine bacterial flora and uterine lesions in bitches with cystic endometrial hyperplasia (pyometra).
The Veterinary Record, 143(24), 659-61, 1998.
DICKSON, S. Sepsis and multiple organ failure. Anaesthesia & Intensive Care Medicine, 10(4), 165-168, 2009.
EGENVALL, A.; et al. Breed risk of pyometra in insured dogs in Sweden.
Journal of Veterinary Internal Medicine / American College of Veterinary Internal Medicine, 15(6), 530-538, 2009.
FALDYNA, M.; LAZNICKA, A.; TOMAN, M. Immunosuppression in bitches with pyometra. The Journal of Small Animal Practice, 42(1), 5-10, 2001.
FEITOSA, F. L. F. Semiologia Veterinária - A Arte do Diagnóstico - 3a
edição. Rio de Janeiro: Roca. 2014
FELDMAN, E. C.; NELSON, R. W.; REUSCH, C.; SCOTT-MONCRIEFF, J. C. R.; BEHREND, E. N. Canine and feline endocrinology (4a edição).
Philadelphia: Saunders, 2014.
FELICIANO, M. A. R.; MUZZI, L. A. L.; LEITE, C. A. L.; JUNQUEIRA, M. A. Ultra-sonografia bidimensional convencional, de alta resolução e tridimensional no acompanhamento da gestação em cadela. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária E Zootecnia, 59(5), 1333-1337.
2007.
FELL, H. B.; ROBISON, R. The development and phosphatase activity in vivo and in vitro of the mandibular skeletal tissue of the embryonic fowl. The Biochemical Journal, 24(6), 1905-21. 1930.
FERREIRA, P. C. C. (2007). Avaliação da hemodiafiltração no período peri- operatório da ovário-salpingo-histerectomia, em cadelas com
piometra e refratárias ao tratamento conservador da insuficiência renal aguda. Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade de São Paulo.
40
Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10137/tde- 09042007-163457/en.php. Acessado em 27 de agosto de 2016.
Fransson, B. A.; Ragle, C. A. Canine pyometra; an update on pathogenesis and treatment. Compendium, 25(8), 602-610.2003.
GARCIA FILHO, S. P.; MARTINS, L. L.; SILVA MACHADO, A.; FERNANDES, M. R.. Piometra em cadelas: Revisão de Literatura. Revista Científica Eletrônica de Medicina Veterinária, 78(1679-7353), 174. 2012.
Disponível em: http://www.revista.inf.br. Acessado em 02 de setembro 2016.
HACK, C. E.; AARDEN, L. A.; THIJS, L. G.. Role of cytokines in sepsis.
Advances in Immunology, 66, 101-95. 1997.
HAFEZ, B.; HAFEZ, E. S. E. Reprodução Animal (7a edição). São Paulo:
Manole. 2004.
HAGMAN, R.; GREKO, C. Antimicrobial resistance in Escherichia coli isolated from bitches with pyometra and from urine samples from other dogs. The Veterinary Record, 757(7), 193-6.2005.
HAGMAN, R.; et al. Differentiation between pyometra and cystic endometrial hyperplasia/mucometra in bitches by prostaglandin F2a metabolite analysis. Theriogenology, 66(2), 198-206. 2005.
HAGMAN, R.; et al. Differentiation between pyometra and cystic endometrial hyperplasia/mucometra in bitches by prostaglandin F2a metabolite analysis. Theriogenology, 66(2), 198-206. 2006.
HAGMAN, R.; RONNBERG, E.; PEJLER, G. Canine Uterine Bacterial Infection Induces Upregulation of Proteolysis-Related Genes and Downregulation of Homeobox and Zinc Finger Factors. PLoS ONE, 4(11), e8039. 2009.
HENSON, K. Sistema Reprodutivo. In D. J. M. Rose E. Raskin (Ed.), Citologia de Cães e Gatos: Atlas Colorido e Guia de Interpretação . 2a edição.
Rio de Janeiro: Elsevier Brasil. 2011. p. 472
HERATH, S., et al. Expression and function of Toll-like receptor 4 in the endometrial cells of the uterus. Endocrinology, 747(1), 562-70. 2006.
Herath, S., et al. Bacterial lipopolysaccharide induces an endocrine switch from prostaglandin F2alpha to prostaglandin E2 in bovine endometrium.
Endocrinology, 750(4), 1912-20. 2009.
HORNE, A. W.; STOCK, S. J.; KING, A. E. Innate immunity and disorders of the female reproductive tract. Reproduction 735(6), 739-49. 2008.
ISHIGURO, K., et al. Reduction of mucin-1 gene expression associated with increased Escherichia coli adherence in the canine uterus in the early stage of dioestrus. The Veterinary Journal, 773(2), 325-332. 2007.
41
ISHIKAWA, Y.; et al. Changes in interleukin-6 concentration in peripheral blood of pre- and post-partum dairy cattle and its relationship to postpartum reproductive diseases. The Journal of Veterinary Medical Science / the Japanese Society of Veterinary Science, 66(11), 1403-8. 2004.
Jeffcoate, I. Fisiología y endocrinología de la reproducción en la perra. In G. Simpson, G. C. W. ; England, M. H.; D. Segura Aliaga, Manual de reproducción y neonatología en pequenos animales. Reino Unido:
BSAVA. 2000. p. 316.
JOHNSTON, S. D.; KUSTRITZ, M. V. R.; OLSON, P. S. Canine and Feline Theriogenology .1a edição. Philadelphia: Saunders. 2001.
KARLSSON, I.; et al. Pathogenic Escherichia coli and lipopolysaccharide enhance the expression of IL-8, CXCL5, and CXCL10 in canine endometrial stromal cells. Theriogenology, 64(1), 34-42. 2015.
KIDA, K.; et al. Lactoferrin expression in the canine uterus during the estrous cycle and with pyometra. Theriogenology, 66(5), 1325-33. 2006.
KIM, K. S.; KIM, O. Cystic endometrial hyperplasia and endometritis in a dog following prolonged treatment of medroxyprogesterone acetate. Journal of
Veterinary Science, 6(1), 81-2. 2005.
KOLF-CLAUW, M.; et al. Development of a pig jejunal explant culture for studying the gastrointestinal toxicity of the mycotoxin deoxynivalenol:
histopathological analysis. Toxicology in Vitro : An International Journal Published in Association with BIBRA, 23(8), 1580-4. 2009.
KRYSKO, D. V.; et al. Emerging role of damage-associated molecular patterns derived from mitochondria in inflammation. Trends in Immunology, 32(4),
157-64. 2011.
LEITNER, M.; AURICH, J. E.; GALABOVA, G.; AURICH, C.; WALTER, I. Lectin binding patterns in normal canine endometrium and in bitches with
pyometra and cystic endometrial hyperplasia. Histology and
Histopathology, 18(3), 787-95. 2003.
LEWIS, G. S. Steroidal regulation of uterine resistance to bacterial infection in livestock. Reproductive Biology and Endocrinology : RB&E, 1, 117. 2003. MICHELON, T.; SILVEIRA, J. G.; GRAUDENZ, M.; NEUMANN, J. Imunologia
da gestação. Rev. AMRIGS, 50(2), 145-151.2006
MORAN, A. P.; PRENDERGAST, M. M.; APPELMELK, B. J. Molecular mimicry of host structures by bacterial lipopolysaccharides and its contribution to disease. FEMS Immunology and Medical Microbiology, 16(2), 105-15.
1996.
MOREIRA, H. R.; MIRANDA, S. A.; DE BRITO, A. B.; PEREIRA, W. L. A.; DOMINGUES, S. F. S. Complexo hiperplasia endometrial cística-piometra em uma cadela tratada com acetato de medroxiprogesterona como método
42
contraceptivo. Revista Portuguesa de Ciências Veterinárias, 103, 233 238. 2008
MOSHAGE, H. J.; et al. The effect of interleukin-1, interleukin-6 and its interrelationship on the synthesis of serum amyloid A and C-reactive protein in primary cultures of adult human hepatocytes. Biochemical and
Biophysical Research Communications, 155(1), 112-117. 1988.
NELSON, R. W.; COUTO, C. G. Medicina interna de pequenos animais. In
Medicina interna de pequenos animais. 2010. pp. 976 - 983.
Oliveira, É. C.; Marques Jr., A. P. Endocrinologia reprodutiva e controle da fertilidade da cadela. Revista Brasileira de Reprodução Animal, 30(12),
11-18. 2006.
PANTALEO, M.; PICCINNO, M.; RONCETTI, M.; MUTINATI, M.; RIZZO, A.; SCIORSCI, R. L. Evaluation of serum concentrations of interleukin (IL)-4, IL-10, and IL-12 during pregnancy in bitches. Theriogenology, 79(6), 970 973. 2013.
QUAYLE, A. J. The innate and early immune response to pathogen challenge in the female genital tract and the pivotal role of epithelial cells. Journal of Reproductive Immunology, 57(1-2), 61-79. 2002.
RANDALL, K. J.; TURTON, J.; FOSTER, J. R. Explant culture of
gastrointestinal tissue: a review of methods and applications. Cell Biology and Toxicology, 27(4), 267-84. 2011.
ROBERTSON, C. M.; COOPERSMITH, C. M. The systemic inflammatory response syndrome. Microbes and Infection, 8(5), 1382-1389. 2006.
ROMANO, M.; et al. Role of IL-6 and its soluble receptor in induction of chemokines and leukocyte recruitment. Immunity, 6(3), 315-25. 1997.
SAUT, J. P. E.; HEALEY, G. D.; BORGES, A. M.; SHELDON, I. M. Ovarian steroids do not affect bovine endometrial cytokine or chemokine responses to Escherichia coli or LPS in vitro. Reproduction, 148(6), 593-606. 2014. SCHAEFER, T. M.; DESOUZA, K.; FAHEY, J. V.; BEAGLEY, K. W.; WIRA, C.
R. Toll-like receptor (TLR) expression and TLR-mediated
cytokine/chemokine production by human uterine epithelial cells.
Immunology, 112(3), 428-36. 2004.
Sheldon, I. M.; Bromfield, J. J. Innate immunity in the human endometrium and ovary. American Journal of Reproductive Immunology, 66 Suppl 1, 63 7 1 .2011.
SHELDON, I. M.; CRONIN, J.; GOETZE, L.; DONOFRIO, G.; SCHUBERTH, H.J. Defining postpartum uterine disease and the mechanisms of infection and immunity in the female reproductive tract in cattle. Biology of
Reproduction, 81(6), 1025-32. 2009.
43
receptors and prostaglandins in the canine endometrium. Journal of Reproductive Immunology, 96(1-2), 45-57. 2012.
SILVA, E.; LEITÃO, S.; FERREIRA-DIAS, G.; LOPES DA COSTA, L.;
MATEUS, L. Prostaglandin synthesis genes are differentially transcripted in normal and pyometra endometria of bitches. Reproduction in Domestic
Animals = Zuchthygiene, 44 Suppl 2, 200-3. 2009.
SILVA, E., et al. Gene transcription of TLR2, TLR4, LPS ligands and
prostaglandin synthesis enzymes are up-regulated in canine uteri with cystic endometrial hyperplasia-pyometra complex. Journal of
Reproductive Immunology, 84(1), 66-74. 2010.
SILVEIRA, C. P. B., et al. Estudo retrospectivo de ovariossalpingo-
histerectomia em cadelas e gatas atendidas em Hospital Veterinário Escola no período de um ano. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaria E Zootecnia, 65(2), 335-340. 2013.
Sugiura, K.; et al. Effect of ovarian hormones on periodical changes in immune resistance associated with estrous cycle in the beagle bitch.
Immunobiology, 209(8), 619-627. 2004.
TIZARD, I. R.; ABEL, L. J. I m u nologia veterinária : u m a introd u ç äo 6a
edição. São Paulo: Roca. 2002
TROWELL, O. A. The culture of mature organs in a synthetic medium.
Experimental Cell Research, 16(1), 118-47. 1959.
TSUMAGARI, S., et al. Induction of canine pyometra by inoculation of
Escherichia coli into the uterus and its relationship to reproductive features.
Animal Reproduction Science, 87(3), 301-308. 2005.
VOGEL, V.; SHEETZ, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nature Reviews. Molecular Cell Biology, 7(4), 265-75. 2006.
WANG, C.; WU, J.; ZONG, C.; XU, J.; JU, H.X. Chemiluminescent Immunoassay and its Applications. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 40(1), 3-10. 2012.
WANKE, M. M.; GOBELLO, C. Ciclo estral canino. In M. M. Wanke & C.
Gobello (Eds), Reproducción en caninos y felinos domésticos. Bueno
Aires: Intermédica. 2006. p. 309.
Zähringer, U.; Lindner, B.; Inamura, S.; Heine, H.; Alexander, C.TLR2 -
promiscuous or specific? A critical re-evaluation of a receptor expressing apparent broad specificity. Immunobiology, 218(3-4), 205-24. 2008.