O polimorfismo selecionado está localizado no éxon 2 do gene adiponectina. A amplificação de um segmento de 372 pb dessa região, em que está contido o polimorfismo, foi realizada com a seguinte ciclagem: a desnaturação inicial foi realizada a 95ºC por 2 minutos, seguida de 35 ciclos compostos por desnaturação a 95ºC por 30 segundos, anelamento a 60ºC por 30 segundos, e polimerização a 72ºC por 1 minuto. A extensão final foi a 72ºC por 10 minutos.
Para análise deste polimorfismo os primers sense e antisense utilizados foram: 5´ GCAGCTCCTAGAAGTAGACTCTGCTG 3´ e
Métodos 14
A este produto de PCR foi adicionada a enzima de restrição SmaI (New England BioLabs®
Inc, USA), podendo ser observado 3 genótipos: TT – 372 pb
TG – 372 pb + 209 pb + 163 pb
GG – 209 pb + 163 pb (Li et al., 2007). Abaixo estão exemplificados os resultados obtidos com a amplificação (Figura 1) e os três possíveis genótipos (Figura 2).
Figura 1 - Eletroforese em gel de agarose 2%, corado com Brometo de Etídio, mostrando a amplificação de parte do gene Adiponectina.
Figura 2 - Eletroforese em gel de agarose a 3%, mostrando a genotipagem do polimorfismo +45 do gene Adiponectina. A = indivíduo com genótipo TG, B = indivíduo com o genótipo TT, C = indivíduo com o genótipo GG, D = controle negativo (H2O) e E = marcador de peso molecular (100pb).
Métodos 15
2.3.4.2. Adiponectina -11377C/G (rs266729):
O polimorfismo selecionado está localizado na região promotora do gene
adiponectina. A amplificação de um segmento de 433 pb dessa região, em que está
contido o polimorfismo, foi realizada com a seguinte ciclagem: a desnaturação inicial foi realizada a 95ºC por 2 minutos, seguida de 35 ciclos compostos por desnaturação a 95ºC por 30 segundos, anelamento a 50ºC por 30 segundos, e polimerização a 72ºC por 1 minuto. A extensão final foi a 72ºC por 10 minutos.
Para análise deste polimorfismo os primers sense e antisense utilizados foram: 5´ CTTACATAAAATGTGATATTGGA 3´ e
5´ CTCTGTCTGAGAAAATTCTG 3´, respectivamente.
A este produto de PCR foi adicionada a enzima de restrição HhaI (New England BioLabs®Inc, USA), podendo ser observado 3 genótipos:
CC – 433 pb
GC – 433 pb + 309 pb + 124 pb
GG – 309 pb + 124 pb (Kyriakou et al., 2008 com modificações). Abaixo estão exemplificados os resultados obtidos com a amplificação (Figura 3) e os três possíveis genótipos (Figura 4).
Figura 3 - Eletroforese em gel de agarose 2%, corado com Brometo de Etídio, mostrando a amplificação de parte do gene Adiponectina.
Métodos 16
Figura 4 - Eletroforese em gel de agarose a 3%, mostrando a genotipagem do polimorfismo -11377 do gene Adiponectina. A = indivíduo com genótipo CG, B = indivíduo com o genótipo CC, C = indivíduo com o genótipo GG e D = marcador de peso molecular (100pb).
2.3.4.3. IL-10 -1082 G/A (rs1800896):
O polimorfismo selecionado está localizado na região promotora do gene IL-10. A amplificação de um segmento de 136 pb dessa região, em que está contido o polimorfismo, foi realizada com a seguinte ciclagem: a desnaturação inicial foi realizada a 94ºC por 5 minutos, seguida de 35 ciclos compostos por desnaturação a 94ºC por 30 segundos, anelamento a 58ºC por 45 segundos, e polimerização a 72ºC por 55 segundos. A extensão final foi a 72ºC por 10 minutos.
Para análise deste polimorfismo os primers sense e antisense utilizados foram: 5´ TCTTACCTATCCCTACTTCC 3´ e
5´ CTCGCCGCAACCCAACTGGC 3´, respectivamente.
A este produto de PCR foi adicionada a enzima de restrição MnlI (New England BioLabs®
Inc, USA), que deu origem a 3 possíveis genótipos: AA – 136 pb
AG – 136 pb + 104 pb + 32 pb
GG – 104 pb + 32 pb (Chatterjee et al., 2009).
Métodos 17
Abaixo estão exemplificados os resultados obtidos com a amplificação (Figura 5) e os três possíveis genótipos (Figura 6).
Figura 5 - Eletroforese em gel de agarose 2%, corado com Brometo de Etídio, mostrando a amplificação de parte do gene IL-10.
Figura 6 - Eletroforese em gel de agarose a 3%, mostrando a genotipagem do polimorfismo -1082 do gene IL-10. A = indivíduo com genótipo GG, B e E = indivíduos com o genótipo AA, C e F = indivíduos com o genótipo AG, D = indivíduo não genotipado, G = controle negativo (H2O) e H = marcador de peso molecular (100pb).
2.3.4.4. IL-6 -174 G/C (rs1800795):
O polimorfismo selecionado está localizado na região promotora do gene IL-6. A amplificação de um segmento de 243 pb dessa região, em que está contido o polimorfismo, foi realizada com a seguinte ciclagem: a desnaturação inicial foi realizada a 95ºC por 5 minutos, seguida de 30 ciclos compostos por desnaturação a 95ºC por 1 minuto, anelamento a 55ºC por 1 minuto, e polimerização a 72ºC por 1 minuto. A extensão final foi a 72ºC por 5 minutos.
Métodos 18
Para análise deste polimorfismo os primers sense e antisense utilizados foram: 5´ TTGTCAAGACATGCCAAAGTGCT 3´ e
5´ GGGAAAATCCCACATTTGATAA 3´, respectivamente.
A este produto de PCR foi adicionada a enzima de restrição NlaIII (New England BioLabs®
Inc, USA), que deu origem a 3 possíveis genótipos: GG – 230 pb + 13 pb
GC – 230 pb + 122 pb + 108 pb + 13 pb
CC – 122 pb + 108 pb + 13 pb (Jahromi et al., 2000). Abaixo estão exemplificados os resultados obtidos com a amplificação (Figura 7) e os três possíveis genótipos (Figura 8).
Figura 7 - Eletroforese em gel de agarose 2%, corado com Brometo de Etídio, mostrando a amplificação de parte do gene IL-6.
Métodos 19
Figura 8 - Eletroforese em gel de agarose a 3%, mostrando a genotipagem do polimorfismo -174 do gene IL-6. A = indivíduo com genótipo GC, B = indivíduo com o genótipo CC, C e D = indivíduos com o genótipo GG e D = marcador de peso molecular (100pb).
2.3.4.5. TNFA -308 G/A (rs1800629):
O polimorfismo selecionado está localizado na região promotora do gene TNFA. A amplificação de um segmento de 107 pb dessa região, em que está contido o polimorfismo, foi realizada com a seguinte ciclagem: a desnaturação inicial foi realizada com 1 ciclo composto por desnaturação a 94ºC por 3 minutos, anelamento a 60ºC por 1 minuto, e polimerização a 72ºC por 1 minuto, seguida de 35 ciclos compostos por desnaturação a 94ºC por 1 minuto, anelamento a 60ºC por 1 minuto, e polimerização a 72ºC por 1 minuto. O ciclo de extensão final foi composto por 94ºC por 1 minuto, anelamento a 60ºC por 1 minuto, e polimerização a 72ºC por 5 minutos.
Para análise deste polimorfismo os primers sense e antisense utilizados foram: 5´ AGG CAA TAG GTT TTG AGG GCC AT 3´ e
5´ TCC TCC CTG CTC CGA TTC CG 3´, respectivamente.
Métodos 20
A este produto de PCR foi adicionada a enzima de restrição NcoI (New England BioLabs®Inc, USA), que deu origem a 3 possíveis genótipos:
AA – 107 pb
GA – 107 pb + 87 pb + 20 pb
GG – 87 pb + 20 pb (Gonzalez-Sanchez et al., 2006). Abaixo estão exemplificados os resultados obtidos com a amplificação (Figura 9) e os três possíveis genótipos (Figura 10).
Figura 9 - Eletroforese em gel de agarose 2%, corado com Brometo de Etídio, mostrando a amplificação de parte do gene TNFA.
Figura 10 - Eletroforese em gel de agarose a 3%, mostrando a genotipagem do polimorfismo -308 do gene TNFA. A = marcador de peso molecular (100pb), B e C = indivíduos com genótipo GG, D e E = indivíduos com o genótipo GA.
A B C D E A B C D E
Métodos 21