15000 16000 17000 18000 19000 20000 21000 22000 23000 24000 25000 26000 27000 28000 29000 30000 31000 32000 33000 34000 % 0 100
20090911_BBL 54 (0.935) M1 [Ev-509448,It35] (Gs,0.750,500:2199,1.00,L33,R33); Cm (3:58) TOF MS ES+ 1.02e5 28305.0000 28286.0000 15575.0000 16961.0000 16929.0000 21317.0000 18722.0000 19870.0000 20263.0000 21455.0000 23561.000024764.000025198.0000 26322.000027721.000028032.0000 28402.0000 28505.0000 28941.0000 30702.0000 32066.0000 34488.0000 31313.0000 32546.0000
Figura 08. Análise por Espectrometria de Massas com Ionização por Eletrospray. Espectro de massa deconvoluido mostrando a massa média de BbL.
As lectinas de leguminosas, normalmente, apresentam-se como dímeros ou tetrâmeros, compostos por monômeros iguais ou diferentes e com massa molecular em torno de 25 a 30 kDa (SHARON & LIS, 1989). A lectina de sementes de B. bauhinioides, por cromatografia de exclusão molecular em coluna de TSK Gel em condições não desnaturantes, apresentou um pico único e simétrico correspondendo a uma massa molecular estimada de aproximadamente 108 kDa (Figura 09). Esse resultado, comparado com aqueles observados por SDS-PAGE e por espectrometria de massas, sugere que, em solução, a lectina de sementes de B. bauhinioides assume uma estrutura tetramérica, composta por subunidades idênticas, similar ao reportado para várias outras lectinas de leguminosas (YOUNG et al., 1985; OLIVEIRA et al., 2002; NAGANO et al., 2008; GALEGO DEL SOL et al., 2007).
Figura 09. Estimativa da Massa M cromatografia de exclusão molecul padrões de massa molecular utilizad Cadeia α da CoN-br 25 kDa. BbL a
BbL demonstrou ser hemaglutinante mesmo após atividade hemaglutinante com superiores a 70 ºC (Figura 10
A atividade hemaglutin títulos de hemaglutinação tiv situado entre 8,0 e 9,0, indic proteína. No entanto, a ativida sendo que, a lectina teve sua a (Figura 10 B).
a Molecular Nativa. A massa molecular da lectina de Bb ular em coluna de Sílica Gel (TSK-GEL) como descrito ados foram: (A) β-amilase 200 kDa, (B) Con-Br nativa 100 apresentou uma massa molecular estimada de aproximadam
er uma proteína termo-estável que mantêm s incubação a 60 ºC por 1 hora. Contudo, a ompletamente perdida quando exposta a temper
A).
tinante de BbL também é resistente a uma ampla tiveram alcançaram seus valores mais altos no icando que esta é a faixa de pH ótimo para a idade hemaglutinante foi reduzida em valores de
atividade totalmente perdida pela incubação da le
BbL foi estimada por ito no item 3.4.6. Os 00 kDa, BSA 66 kDa,
amente 108 kDa.
m sua atividade a lectina teve sua eraturas iguais ou la faixa de pH. Os o intervalo de pH a atividade dessa e pH mais baixos, lectina em pH 4,0
Figura 10: Propriedades Físico-q térmica. (B) Estabilidade a variações
Uma das característica possuem sítios de ligação a c estruturas. Esses íons atuam e ausência resulta em uma in carboidratos (LORIS et al., sementes de B. bauhinioides solução de EDTA 0,1 M. A ad atividade hemaglutinante dess da maioria das lectinas de le necessita de íons metálicos p proteína, estão fortemente liga lectinas de sementes de espéc Bauhina pentandra (SILVA EDTA, enquanto que, a lectina mesma forma que BbL, não quelante.
químicas da lectina de sementes de B. bauhinioide es de pH.
icas principais das lectinas de leguminosas é o f cátions divalentes, principalmente cálcio e man estabilizando a estrutura do sitio de ligação a ca
instabilidade local e na perda da capacidade , 2004). Contudo, a atividade hemaglutinante não foi afetada após diálise exaustiva da proteí adição de Ca2+ e/ou Mn2+ à lectina dialisada tamb essa proteína. Estes resultados sugerem que BbL
leguminosas (LORIS et al., 1998; CAVADA et para sua atividade ou estes íons, se presentes gados a molécula e não são quelados pelo EDTA. écies pertencentes ao gênero Bauhinia, a lectina A et al., 2001) teve sua atividade hemaglutina
ina de sementes de B. variegata Candida (SILVA ão teve sua atividade hemaglutinante afetada
des. (A) Estabilidade
fato de que estas anganês, em suas carboidratos e sua de de ligar-se a nte da lectina de teína nativa contra mbém não afetou a L, diferentemente et al., 2001), não es na estrutura da A. Com relação às na de sementes de inante inibida por A et al., 2007), da a por este agente
4.3- Atividade Pró-inf
Após administração s bauhinioides em diferentes c animais tratados com a dose observada indução significativ a administração da lectina (0. permaneceu significativo em r A). O cálculo da área sob a c maior do que o grupo contro outras lectinas de leguminos macrocarpa (ALENCAR et espécies pertencentes ao gêner formação de edema de pata.
Figura 11: Edema de Pata induzi traseira direita de ratos. O controle (tempo zero) e 30, 60, 120, 180 e 24 os vários tempos e o tempo zero. ( S.E.M. (n=6). *p< 0.05 comparado a
inflamatória da Lectina de Sementes de B. bauh
subcutânea intraplanar da lectina de sement concentrações, foi observada uma significativa se de 1,0 mg/kg, sendo que, nas demais doses t tiva de edema. O edema de pata atingiu o seu pico (0.48 ± 0.03 mL) comparado com o controle (0.
relação ao grupo controle por um período de 32 a curva mostrou que o edema causado pela lecti role (Figura 11 B). Respostas semelhantes foram osas, como por exemplo, as lectinas de semen
t al., 2004), Erythrina velutina (MORAES et ero Canavalia (ASSREUY et al., 2009) que tamb
zido por BbL. A lectina foi administrada s.c. (0,01; 0,1 e le negativo recebeu salina estéril (0,01 mL/Kg ). O edem 240 min após a injeção da lectina. (A) Variação do volume (B) área sob a curva (ASC) determinada pelo método do
o a salina; #p< 0.05 comparado a BbL 0,1 e 0,01 mg/kg
uhinioides.
ntes de Bauhinia a indução de nos s testadas, não foi ico três horas após (0.01± 0.00 mL) e 2 horas (Figura 11 ctina foi 3,6 vezes ram relatadas para entes de Vatairea t al., 1996) e de mbém induziram a
1 e 1 mg/Kg) na pata ema foi medido antes me da pata (mL) entre do trapézio. Média ±
A atividade pró-inflam intensidade pela incubação pr (Figura 12). Estes resultados m do sítio de ligação a carboi envolvidas no processo infla marcante de várias lectinas d demonstrado a importância do sí inflamação (ALENCAR et al., 1997).
Figura 12: Efeito Inibitório de C mg/Kg) foi administrada por via controles receberam salina estéril ou tempo zero. (B) Área sob a curva (A
comparado a salina; @p< 0.05 compa
Com a finalidade de id inflamatória, foi avaliado o ef que a indometacina, um inib inflamatória da lectina (Figura
amatória de BbL (0.46 ± 0.03 mL) foi inibida e prévia da lectina com 0,1 M de D-galactose (0 s mostram que a atividade edemática ocorre med
oidratos da lectina com os carboidratos presen flamatório. A atividade pró-inflamatória é um de leguminosas específicas para galactose e vár
sítio ligante à carboidratos na elicitação dos efeitos ., 2003, 2005, 2007; MORAES et al., 1996; BE
Carboidratos Sobre o Edema de Pata induzido por B a intraplantar (s.c.) sozinha ou em associação a galacto ou galactose. (A) variação do volume da pata (mL) entre o (ASC) determinada pelo método do trapézio. Média ± S.E
parado a BbL 1,0 mg/kg.
identificar o mecanismo pelo qual BbL exerce su efeito de moduladores farmacológicos. Neste est
ibidor específico da cicloxigenase, não afetou ra 13 B), enquanto que, o L-NAME, um inibidor
em 60 % de sua (0.21 ± 0.01 mL) ediante a interação sentes nas células uma característica ários trabalhos têm s dessas lectinas na ENJAMIM et al., BbL. A lectina (1,0 ctose (0,1mol/L). Os os vários tempos e o .E.M. (n=6). *p< 0.05 sua atividade pró- studo observou-se u a atividade pró- or não-seletivo da
enzima Óxido Nítrico Sintas atividade pró-inflamatória da l que, o edema causado pela lec (Figura 13 B). Esses resultado de sementes de B. bauhinioide oxido nítrico. O NO desemp resposta inflamatória, no enta elucidado (MONCADA et al., formação do edema através participa de forma direta na pe A atividade de liberação de ox de leguminosas (ANDRADE 2009).
Figura 13: Efeito de Moduladores receberam indometacina (5mg/kg; s s.c.). (A) variação do volume da pa determinada pelo método do trapézi a BbL 1,0 mg/kg.
ase, inibiu significativamente o edema no mom a lectina atingiria seu pico máximo (3º hora) (Figu ectina foi 22% vezes menor nos animais tratados dos sugerem que a atividade pró-inflamatória cau ides ocorre através de um mecanismo que envolv mpenham um papel importante na função vasc tanto, o mecanismo pelo qual ele exerce seu efei ., 1991). Enquanto alguns autores acreditam que s da vasodilatação local, outros acreditam que permeabilidade vascular (HUGHES et al., 1990; oxido nítrico tem sido previamente reportada par
E et al., 1999; GADELHA et al., 2005; FIGU
res Farmacológicos sobre o Edema de Pata induzido po ; s.c.) ou L-NAME (30mg/kg; e.v.), 1 hora antes da lectin pata (mL) entre os vários tempos e o tempo zero; (B) área
zio. Média ± S.E.M. (n=6). *p< 0.05 comparado a salina; @
omento em que a igura 13 A), sendo s com o L-NAME ausada pela lectina lve a liberação de ascular durante as feito não está bem ue o NO modula a ue este mediador 0; KUBES, 1995). ara várias lectinas UEIREDO et al.,
por BbL. Os animais tina (BbL 0,1 mg/Kg; ea sob a curva (ASC)
Em condições normais regulado pelo equilíbrio entre do fluido dos vasos, e pelo plasmáticas, que tendem a r inflamatória aguda ocorre o au dos fluidos através dos pe plasmáticas. Quando tais prote um aumento na pressão osmó originado o edema e aumenta (êxtase sanguíneo). O êxtase exudado inflamatório, uma d (MICHAEL & CURRY, 1999
O efeito edematogênic acompanhado por um aument 0.68 g Azul de Evans/g de (Figura 14). Contudo, este efe NAME.
Figura 14: Avaliação da Permeab 0,1 mg/Kg) ou salina (0,1 mL/Kg) mg/Kg, e.v.), 30 minutos antes do s
ais, o movimento de fluidos dentro e fora da m re a pressão hidrostática intravascular, que tende lo efeito oposto da pressão osmótica exercido reter o fluido dentro dos vasos. Porém, dur aumento da pressão hidrostática na microcirculaç pequenos vasos, tornando-os mais permeáve oteínas deixam os vasos sanguíneos e entram no i mótica, o que provoca a saída de mais fluido pa ntando a viscosidade sanguínea que tende a des
se sanguíneo favorece a adesão leucocitária e das principais características da resposta infl 99).
ico de BbL, no momento do seu pico máximo, f nto significante na permeabilidade vascular de 2 e peso da pata) comparado com o grupo contro efeito não foi alterado pelo pré-tratamento dos an
abilidade Vascular Induzida por BbL. Os animais recebe g) por via intraplantar (s.c.). Todos os animais receberam
sacrifício. Média ± S.E.M. (n=6). *p< 0.05 comparado a sa
microcirculação é de a forçar a saída o pelas proteínas urante a resposta ação e a passagem veis às proteínas o interstício, causa para o interstício, esacelerar o fluxo e forma, assim, o nflamatória aguda , foi paralelamente 2,9 vezes (2.55 ± role (0.90 ± 0.11) animais com o L- beram a lectina (BbL m azul de Evans (25 salina.
5-CONCLUSÃO
Com base nos resultados obtidos podemos concluir que uma lectina específica para galactose de sementes de Bauhinia bauhinioides Mart foi purificada através de um protocolo simples, reproduzível e eficiente. A lectina apresentou uma marcante atividade pró- inflamatória, atividade esta que demonstrou ocorrer mediante interação do seu sitio de ligação a carboidratos com as células envolvidas no processo inflamatório, em um mecanismo que envolve a participação do oxido nítrico. Estes resultados reforçam a importância das interações proteínas-carboidratos nas células e fornecem subsídios para a utilização de lectinas vegetais com ferramentas biotecnológicas em estudos envolvendo os mecanismos da resposta inflamatória.
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