Moralsk karriere

4.6.1 Ensaios preliminares utilizando diferentes fontes de carbono

Como uma forma de avaliar as fontes de carbono que o microrganismo isolado é capaz de converter em hidrogênio, realizou-se testes preliminares em frascos de penicilina de 50 mL contendo meio CH modificado, no qual a sacarose foi substituída por diferentes monossacarídeos, dissacarídeos, polissacarídeos e não carboidratos como fontes de carbono, representados na Figura 8. Todos os reagentes foram de grau analítico P.A (Sigma-AldrichTM_{). As concentrações testadas das fontes de carbono foram 2 g/L e 10 g/L,}

com o pH inicial do meio de 6,5. A cultura celular do isolado utilizada como inóculo foi previamente centrifugada e ressuspensa em solução salina (NaCl - 0,9 m/v) para atingir D.O. a 600 nm de 0,08, correspondendo a 4,05. 107 _células/mL.

Em cada frasco de penicilina contendo 14 mL do meio de cultura CH com diferentes fontes de carbono foi adicionado 1 mL de inóculo. Após inoculados, gás argônio foi borbulhado nos frascos, os quais, em seguida, foram fechados com tampa de borracha e com lacre de alumínio e mantidos a 35 °C. Após o período de 72 h, o gás do head-space foi analisado por cromatografia a gás. Todos os ensaios foram realizados em triplicatas independentes e os resultados apresentados como médias com seus respectivos desvios das médias.

Amostras do meio de cultura no início e no fim dos ensaios de fermentação foram retiradas para a determinação do carbono orgânico total (COT), da D.O. a 600 nm e do pH.

Figura 8 - Fontes de carbono utilizadas nos ensaios preliminares de produção de H2 pela cultura isolada.

4.6.2 Ensaios de fermentação com diferentes pH iniciais e temperaturas

O pH inicial e a temperatura de incubação mais adequado para a produção de H2

pela bactéria isolada foram avaliados em ensaios de fermentação em frascos de penicilina de 50 mL, contendo 14 mL de meio de cultura CH. Nos ensaios com diferentes pH iniciais o meio CH continha 15,0 g/L de glicose e o pH inicial foi ajustado com NaOH (6,25 mol/L) ou HCl (7,0 mol/L) em 4,0, 5,0, 6,0, 7,0 e 8,0 (± 0,02) e incubados a 35 °C por 72 horas.

Nos ensaios em diferentes temperaturas utilizou-se o meio de cultura CH contendo 15 g/L de glicose, o pH inicial ajustado em 7,0 e as temperaturas de incubação testadas foram de 25, 35 e 50 °C por 72 horas.

Como inóculo para os ensaios foi utilizado 1,0 mL da cultura isolada crescida em meio CH, pH 7,0 e 35 °C por 72 horas. A D.O. a 600 nm do inóculo foi padronizada em 0,08. Os frascos foram borbulhados com gás argônio e, em seguida, fechados com tampa de borracha e com lacre de alumínio. Todos os ensaios foram realizados em triplicata

Monossacarídeos Arabinose Frutose Glicose Galactose Manose Xilose Dissacarídeos Sacarose Celobiose Lactose Trealose Polissacarídeos Amido de Milho Celulose Microcristalina Não Carboidratos Ác. Acético Ác. Lático Ác. Propiônico Ác. Fórmico Ác. Butírico Etanol Glicerol

independentes e os resultados apresentados como médias com seus respectivos desvios das médias. Após o tempo de incubação dos ensaios (72 h), a composição do gás do head- space foi determinada.

Amostras do meio de cultura no início e no final dos ensaios de fermentação foram retiradas para a determinação da concentração de açúcares redutores totais (ART), a D.O. a 600 nm e o pH.

Na figura 9 está representado o esquema simplificado das principais etapas destes ensaios.

Figura 9 - Esquema das principais etapas realizadas nos ensaios de diferentes pHs iniciais e diferentes temperaturas de incubação da cultura isolada produtora de H2.

4.6.3 Ensaios cinéticos de fermentação utilizando diferentes

concentrações de glicose e de galactose

Ensaios cinéticos foram realizados visando estudar o microrganismo isolado em relação a produção de H2, ao crescimento celular, ao consumo de substrato e variação do

diferentes concentrações iniciais de glicose P.A. (VetecTM_{) e galactose P.A. (Sigma-}

AldrichTM_{). Os ensaios para a produção de H}

2 utilizando diferentes concentrações de

galactose foram realizados substituindo-se a fonte de carbono do meio CH por galactose nas concentrações de 1,0, 5,0, 10,0, 15,0, e 20,0 g/L, e os ensaios utilizando diferentes concentrações de glicose foram realizados substituindo-se a fonte de carbono do meio CH por glicose nas concentrações de 2,0, 5,0, 10,0, 15,0, e 20,0 g/L. Os ensaios foram realizados em tubos de Durham® _{de 2 L contendo 600 mL de meio, pH inicial de 7,0 e}

adicionando–se 45 mL do inóculo com D.O. 0,08 a 600 nm. Gás argônio foi borbulhado nos frascos antes de iniciar os testes e, em seguida, fechados com tampa de borracha e incubados a 35 °C pelo tempo de duração do ensaio de fermentação. Durante os ensaios, periodicamente, foram retiradas amostras de 5 mL de meio com seringa estéril para a leitura da D.O. a 600 nm, para a determinação da concentração de açúcares redutores totais (ART), dos metabólitos solúveis e do pH. A composição do gás do head-space foi determinada retirando-se uma alíquota de 100 ʅL com uma seringa gás tight. O ensaio foi terminado quando o volume de H2 se manteve constante. Todos os experimentos foram

realizados em triplicatas ou duplicatas de forma independente, e os resultados apresentados como a média e seus desvios médios.

4.6.4 Cálculo do Rendimento e Eficiência dos Ensaios de Fermentação

O volume de H2 no head-space dos frascos de fermentação foi calculado

multiplicando-se o volume total (mL) do head-space pela porcentagem do H2 analisada no

gás do head-space. O volume de H2 foi convertido em mmol aplicando-se a Equação dos

número de mol de H2, R é a constante universal de um gás ideal (0,082 atm.L/K.mol) e T

é a temperatura dos ensaios em Kelvin (308K).

O fator de conversão, também denominado de rendimento (Yp/s) de H2 (produto-

p) em relação ao substrato (s) consumido nos ensaios de fermentação foram calculados dividindo-se o número de mmol de H2 produzido durante os ensaios pela quantidade de

substrato consumido em mmol, conforme Equação 10:

�/ = Δ_Δ (Equação 10)

Sendo Yp/s o fator de conversão de substrato em produto no mesmo intervalo de

tempo. ΔS em mmol é a diferença entre o número de mmols do substrato no início e no final do ensaio; ΔP é o número de mmols formado no período do ensaio.

A eficiência da produção de H2 foi calculada de acordo com a Equação 11:

� ���ê ��� % =� / ._{� �ó ��} (Equação 11)

Onde Yteórico refere-se ao rendimento máximo fornecido pelas equações

estequiométricas para a produção de H2 a partir de cada fonte de carbono, no caso das

hexoses, Yteórico é 4 mol de H2/molde hexose, para as pentoses é 3,3 mol de H2/molde

pentose e para os dissacarídeos esse fator é 8 mol de H2/mol de dissacarídeos

(NASCIMBENI, 2013; KONGJAN e ANGELIDAKI, 2009).