Molecular methods

Uma estratégia de PCR em tempo real para a quantificação da carga parasitária diretamente em amostras de sangue periférico e tecido cardíaco de camundongos experimentalmente infectados foi desenvolvida. Uma vez otimizadas as condições básicas da reação, gerou-se a curva padrão para a quantificação do DNA do parasito proveniente do sangue e do coração dos camundongos e verificou-se a sensibilidade, reprodutibilidade e consistência do ensaio como descrito nos tópicos a seguir.

4.1.1 Curvas padrão

Duas curvas com 7 diluições seriadas (1:10) foram geradas a partir dos padrões sanguíneo e tecidual contendo 5 x 107 parasitos/0,1 mL de sangue e 1 x 107 parasitos/30 mg de tecido cardíaco, respectivamente. Para o DNA do controle endógeno (TNF-α), assumiu-se o valor arbitrário de 103 segmentos gênicos para o primeiro ponto de ambas as curvas padrão. Foi observado que os padrões sanguíneo e tecidual apresentavam curva linear para todos os 7 pontos de diluição usados para a quantificação do DNA do

T. cruzi, enquanto o DNA do TNF-α demonstrou linearidade de 103 a 10-1 unidades

arbitrárias. Decidiu-se, então, gerar as curvas padrão sanguínea e tecidual com 5 diluições seriadas dos DNA padrões provenientes de 106 parasitos/30 mg de tecido cardíaco e 5 x 106 parasitos/0,1 mL de sangue para as quantificações do T. cruzi (já que a experiência com o ESF demonstrava parasitemias máximas por volta de 3-4 milhões de parasitos/0,1 mL de sangue), e 103 a 10-1 unidades arbitrárias para o TNF- α (já que diluições maiores não permitiam a amplificação do DNA de TNF- α).

A figura 1A apresenta curvas de amplificação do T. cruzi demonstrando a amplificação de DNA nas 7 diluições seriadas e do TNF-α em 5 diluições seriadas e a figura 1B apresenta as curvas padrão geradas a partir da região linear de cada curva de amplificação. Os valores da eficiência (E) e do R2 da amostra tecidual padrão foram similares, ou seja, E > 90% e R2 > 0,99.

RESULTADOS

Figura 1 - Curva padrão gerada com 7 diluições seriadas dos DNA extraídos do sangue

de camundongos saudáveis acrescidos de epimastigotas da cepa VL-10 do

Trypanosoma cruzi. As linhas pretas referem-se ao DNA do T. cruzi e as cinza ao DNA

do TNF-α. (A) Curvas de amplificação do T. cruzi demonstrando amplificação nas 7 diluições seriadas do DNA proveniente de 5 x 107 parasitos/0,1 mL de sangue e do TNF-α em 5 diluições seriadas. (B) Curvas padrão geradas a partir da região linear de cada curva de amplificação.

4.1.2 Sensibilidade analítica

A sensibilidade analítica do ensaio foi verificada através de diluições seriadas (1:10) dos padrões sanguíneo e tecidual variando de 100 a 0,001 parasitos equivalentes/50 ng de DNA (Fig. 2). O limite de detecção deste ensaio foi de 0,1 parasitos tanto no sangue quanto no tecido cardíaco de camundongos.

Figura 2 - Sensibilidade analítica da PCR em tempo real para a detecção de DNA de

Trypanosoma cruzi proveniente de sangue (quadrados cinza) e tecido cardíaco

(quadrados pretos) de camundongos. O limite de quantificação foi de 0,1 parasitos equivalentes por 50 ng de DNA em ambos, sangue e tecido cardíaco.

4.1.3 Consistência e reprodutibilidade

A consistência da PCR em tempo real foi verificada em todos os ensaios deste estudo, através de quatro reações de PCR para cada amostra, as quais incluíram a quantificação de DNA do parasito e do controle endógeno. A tabela 1 apresenta a consistência de duas reações da PCR em tempo real para a detecção de DNA de T. cruzi e de TNF-α no sangue e no tecido cardíaco de seis camundongos realizados em um único ensaio. Os resultados de consistência dos ciclos de amplificação estão expressos em ciclos Threshold por 50ng de DNA.

Tabela 1 - Consistência de duas reações de PCR em tempo real para a detecção de

DNA de Trypanosoma cruzi e do normalizador TNF-α no sangue e no tecido cardíaco de camundongos.

D.P. = Desvio Padrão

Ciclos Threshold /50ng DNA

Reação 1 Reação 2 Média (D.P.)

Amostra de sangue 1 T. cruzi 19,481 19,663 19,572 (0,129) normalizador 23,344 23,329 23,336 (0,010) 2 T. cruzi 19,835 19,815 19,825 (0,014) normalizador 22,353 22,418 22,385 (0,046) 3 T. cruzi 20,460 20,492 20,476 (0,023) normalizador 23,409 23,347 23,378 (0,044) 4 T. cruzi 16,273 16,347 16,310 (0,052) normalizador 22,093 22,136 22,115 (0,030) 5 T. cruzi 20,521 20,551 20,536 (0,021) normalizador 24,277 24,272 24,275 (0,004) 6 T. cruzi 18,310 18,274 18,292 (0,026) normalizador 23,932 23,897 23,914 (0,025) Amostra de tecido cardíaco 1 T. cruzi 21,355 21,340 21,348 (0,011) normalizador 21,648 21,754 21,701 (0,075) 2 T. cruzi 17,209 17,016 17,113 (0,136) normalizador 20,897 20,918 20,907 (0,015) 3 T. cruzi 17,765 17,728 17,747 (0,026) normalizador 21,038 21,116 21,077 (0,055) 4 T. cruzi 15,452 15,557 15,504 (0,074) normalizador 20,039 20,180 20,109 (0,100) 5 T. cruzi 17,557 17,531 17,544 (0,018) normalizador 20,215 20,420 20,317 (0,145) 6 T. cruzi 16,361 16,349 16,355 (0,008) normalizador 20,696 20,693 20,695 (0,002)

RESULTADOS

Também foi verificada a reprodutibilidade da técnica realizando-se a quantificação de amostras sanguínea e tecidual de um mesmo grupo de camundongos em dois ensaios conduzidos em tempos diferentes (Tabela 2).

Os resultados expressos em parasitos equivalentes/50ng de DNA foram normalizados pelo DNA do TNF-α quantificado para cada amostra.

Tabela 2 - Reprodutibilidade de dois ensaios independentes de PCR em tempo real para

a quantificação do Trypanosoma cruzi no sangue e no tecido cardíaco de camundongos.

Parasitos equivalentes/50ng de DNA

Ensaio 1 Ensaio 2 Média (D.P)

Amostras de sangue 1 0,128 0,120 0,124 (0,01) 2 0,520 0,530 0,525 (0,01) 3 0,818 0,825 0,821 (0,01) 4 10,012 9,879 9,946 (0,09) 5 5,082 5,567 5,324 (0,34) 6 3,965 4,081 4,023 (0,08) Amostras de tecido cardíaco 1 2,673 2,975 2,824 (0,21) 2 2,272 2,388 2,330 (0,08) 3 1,616 1,651 1,634 (0,02) 4 3,962 4,050 4,006 (0,06) 5 0,927 0,775 0,851 (0,11) 6 3,130 3,057 3,093 (0,05) D.P. = Desvio Padrão

4.1.4 Apresentação e interpretação das curvas de amplificação e de dissociação.

A figura 3 ilustra um gráfico típico de amplificação “ Rn” x Ciclo na apresentação logarítmica. As linhas pretas representam as curvas de amplificação de DNA do T. cruzi e as linhas cinza representam as curvas de amplificação de DNA do controle endógeno. “Rn” ou repórter normalizado corresponde ao sinal de fluorescência do corante Sybr®

Green normalizado pelo sinal de fluorescência da referência passiva

(corante ROX) existente na mistura da reação de PCR. A magnitude do sinal de fluorescência normalizada ( Rn) gerada pelo corante Sybr®

Green obtida pela razão

Sybr®Green/ROX subtraída do baseline é calculada a cada ciclo de amplificação da

PCR pelo StepOne Software v2.0. Este tipo de normalização é útil para corrigir variações no volume das reações causadas por imprecisões de pipetagem e/ou eventual e discreta evaporação que podem ocorrer em algumas reações. O Rn é calculado a cada

ciclo como: Rn (ciclo) = Rn (ciclo) – baseline. Baseline corresponde no gráfico de amplificação, a uma linha ajustada para os níveis de fluorescência durante os estágios iniciais da PCR, quando há poucas variações no sinal de fluorescência. O ajuste desta linha é automático, mas pode ser feito manualmente. Já no caso da linha do threshold foi checado, para os resultados de cada placa, se o ajuste automático era realmente o ideal e ajustado manualmente quando necessário. Para isso, a apresentação do gráfico foi alterada para “Log” e a linha do Threshold arrastada para uma região de crescimento exponencial de amplificação localizada acima do baseline, abaixo do plateau e onde as linhas de amplificação apresentavam-se com o melhor paralelamento.

Figura 3 - Gráfico de amplificação ( Rn x ciclo) do DNA do parasito e do controle

endógeno. Apresentação em escala logarítmica para ajustes do Threshold do

Trypanossoma cruzi (linha preta) e do TNF-α (linha cinza).

Na figura 4 podem ser observadas as curvas de dissociação para o DNA amplificado do T. cruzi (linhas pretas) e do controle endógeno (linhas cinza). O pico na curva de dissociação ou curva melt indica a temperatura melting (Tm) do alvo. O Tm observado para o parasito foi ~81o C e para o controle endógeno foi ~79,3o C, tanto nas quantificações sanguíneas quanto nas quantificações teciduais.

RESULTADOS

Figura 4 - Curva de dissociação do DNA amplificado de Trypanosoma cruzi (linhas

pretas) com pico em torno de 81o Ce do DNA de TNF-α (linhas cinza) com pico em torno de 79,3o C.

Os dados apresentados nos subtópicos acima demonstram que a estratégia de PCR em tempo real desenvolvida foi sensível, reprodutível, consistente, e adequada para a quantificação da carga parasitária do T. cruzi no sangue e no coração dos animais experimentais.

4.2 Análises da evolução natural da infecção em camundongos inoculados com a